文章编号: 1004-0609(2005)12-2009-07

氧化亚铁硫杆菌驯化菌株的铜离子运输特性

姚 静, 徐文静, 李红玉

(兰州大学 生命科学学院, 兰州 730000)

摘 要: 以氧化亚铁硫杆菌野生菌(wide T.f)和驯化菌(adapted T.f)为供试菌株, 通过比较野生菌与驯化菌对Cu²⁺的吸收与运输特性, 研究了氧化亚铁硫杆菌驯化菌株的抗铜机理。 结果表明: Cu²⁺对野生菌Fe²⁺的氧化活性影响较大, 当Cu²⁺浓度高于10g/L时, 细菌Fe²⁺氧化活性逐渐降低直至完全抑制; 而经驯化培养的T.f菌, 对重金属铜则具有较高的抗性, 其Fe²⁺氧化活性也较高, Fe²⁺氧化速率加快; 在不同Cu²⁺浓度下, 驯化菌细胞中的Cu²⁺含量总低于野生菌的, 经驯化培养的氧化亚铁硫杆菌与野生菌相比, 具有更高的促进体内Cu²⁺排出的能力, 该排出系统与ATPase的活性有关。

关键词: 氧化亚铁硫杆菌; 铜离子; 运输特性; 氧化活性 中图分类号: Q939.99

文献标识码: A

Transportation characterization of copper ion in adapted Thiobacillus ferrooxidans

YAO Jing, XU Wen-jing, LI Hong-yu

(School of Life Science, Lanzhou University, Lanzhou 730000, China)

Abstract: Copper-resistance mechanisms of the adapted Thiobacillus ferrooxidans were studied in this thesis by comparing the uptake and transport characterization with Cu²⁺ in the wide T.f and the adapted T.f. The results show that wide T.f is largely affected by Cu²⁺ when the content of Cu²⁺is bigger than 10g/L, the active oxidation of Fe²⁺ reduces gradually till completely restraining. The adapted T.f is quite resistant to the heavy metal copper, exhibiting in the active oxidation of Fe²⁺ and its speeding oxidation rate. Further, the accumulation of Cu²⁺in the cell of the adapted T.f is always lower than the wide T.f. Compared with the wide T.f, the adapted T.f possesses higher power in exporting Cu²⁺ and the efflux system is related to the activity of ATPase.

Key words: Thiobacillus ferrooxidans; Cu²⁺ ion; transportation characterization; oxidation activity

铜是许多微生物生长代谢必需的微量元素, 是超氧化物歧化酶(SOD)、 细胞色素C等物质的有效成分, 具有多种生物学功能。 然而, 当环境中的Cu²⁺含量超过一定浓度时, 就会对微生物产生毒害, 甚至杀死菌体^[1]。 氧化亚铁硫杆菌(Thiobacillus ferrooxidans)是一种化能自养菌, 为目前生物浸提硫化矿中研究最多、 最具经济价值的浸矿微生物^[2]。 细菌浸出低品位铜矿石的大量研究及实践表明, Cu²⁺在溶液中的积累对细菌的生长具有较明显的抑制作用^[3]。 通过驯化, 氧化亚铁硫杆菌对多种重金属均具有良好的抗性作用^{[4, 5]}, 在一定的浓度范围内, 可通过逐步增加金属离子的浓度诱导细菌产生金属抗性。 Das通过对氧化亚铁硫杆菌驯化菌在黄铜矿及闪锌矿生物浸提的研究表明, 驯化菌对两种矿物均具有很高的生物溶解能力^[6]。 因此, 深入了解氧化亚铁硫杆菌对重金属铜的抗性及其作用机理对提高氧化亚铁硫杆菌对重金属铜的抗性和获得高效的金属提取率就显得尤为重要。

原核微生物主要通过增加细胞内重金属的排放来控制胞内金属离子的浓度^[7]。 近年来的研究结果表明, 高浓度Cu²⁺可影响氧化亚铁硫杆菌细胞表面化学结构、 蛋白质合成及体内多磷酸盐代谢的变化, 但其具体的作用机制不详^{[4, 8, 9]}。 许多研究表明, 大多数微生物对有毒阳离子、 阴离子的抗性系统主要为质粒上的基因编码^[7]。 但是, Chisholm等^[10]和Ahmod等^[11]对氧化亚铁硫杆菌驯化菌质粒的研究结果表明, 带有驯化菌株质粒的E.coli 并未表现出对铜的抗性, 说明氧化亚铁硫杆菌抗铜基因可能与质粒无关。 随后, Novo等^[8]的研究表明, 在Cu²⁺胁迫下, 驯化菌4种胞质蛋白和7种膜蛋白的合成量均发生了明显变化, 部分胞质蛋白、 膜蛋白发生了磷酸化反应^[8]。 这可能与Chater 等提出膜蛋白可通过蛋白质磷酸化将外界信号传递至胞质蛋白的假说有关^[12-14]。 另有研究表明, 微生物可通过分解体内无机多聚磷酸盐(polyP)水解产生正磷酸盐(Pi)结合重金属, 并分泌到胞外以降低胞内金属离子的浓度。 2003年, Alvarez等^[9]对无机多聚磷酸盐(polyP)在氧化亚铁硫杆菌中含量的变化进行了研究。 结果表明, 该菌中含有由氧和硫组成的电子致密颗粒很有可能就是polyP, 并发现在磷酸盐(Pi)缺乏的细胞中, 无机多聚磷酸盐外切酶(PPX)的含量明显增加, 而细胞内polyP的含量呈持续下降趋势, 推测这可能与PPX含量的增加有关。 综上所述, 高浓度铜离子可影响氧化亚铁硫杆菌细胞表面化学结构、 蛋白质合成和多磷酸盐代谢的变化, 然而上述研究仅仅是一些现象的观察, 有关于该菌到底采取何种机制来抵抗高浓度铜离子的毒害作用, 是否和其它原核微生物抗重金属离子的机制一样, 以建立阳离子、 阴离子外流系统为主, 通过增加细胞内重金属的排放来控制胞内金属离子的浓度目前尚不清楚。 本文作者通过观察Cu²⁺对氧化亚铁硫杆菌氧化活性的影响及该菌对Cu²⁺的吸收与运输作用, 研究了氧化亚铁硫杆菌的抗铜机理。

1 实验

1.1 材料

氧化亚铁硫杆菌野生菌(wide T.f)采自西北某铜矿酸性矿坑水, 经本实验室分离纯化获得。 驯化菌(adapted T.f)经本实验室胁迫驯化所得, 可拮抗浓度为40g/L的Cu²⁺。 培养基为9K液体^[15]。

矿样采自甘肃白银铜矿, 依据矿样采集原则, 在综合考虑了影响矿样取样方法、 样品数量和样品制备过程等后, 按预定方案, 依据现场矿堆的实际形状采集废弃矿约2t, 经粗磨、 中磨后混合均匀, 按照缩分取样原则, 取部分代表性好的样本经细磨后进行物相及成分分析, 矿样物相及成分分析如表1所列。 可见矿样为硫化铜矿, 其主要铜矿物为黄铜矿。

表1 矿样物相及成分分析

Table 1 Analysis of mineral components and attribution(mass fraction, %)

1.2 菌株的驯化

Adapted T.f的驯化过程为: 在装有一定体积9K培养基的三角瓶中加入较低浓度的Cu²⁺(以CuSO₄形式加入), 然后接入要驯化的氧化亚铁硫杆菌进行恒温培养。 开始细菌不适应, 要较长时间才能生长, 待细菌适应并能正常生长后, 将它再转移到含有更高Cu²⁺浓度的培养基中继续培养, 并依此类推, 每转移一次, 都提高Cu²⁺浓度, 但是两次转接之间的梯度不能过大, 否则达不到好的效果。 如此进行下去, 就可获得对Cu²⁺具有较强耐性的菌株。

1.3 Cu²⁺对氧化亚铁硫杆菌Fe²⁺氧化活性的影响

取新配制的9K培养基于100mL锥形瓶中, 其Cu²⁺浓度分别为0、 10、 20、 30、 40g/L, pH值为1.8, 按10%接种量分别接种实验用细菌(野生菌和驯化菌), 于30℃振荡培养, 采用硫酸高铈法测Fe²⁺氧化率^[16]。

1.4 摇瓶实验

称取2.5g粒径不大于50μm的铜矿粉, 于灭菌后的100mL锥形瓶中, 加入灭菌后的9K无铁液体培养基50mL, 用硫酸调pH至2.0, 待pH稳定后, 接种体积分数为10%的T.f菌, 无菌对照中加入40mg/L的氨苄青霉素, 以消除实验过程中可能导致的污染, 彻底保证无菌。 称取质量后, 在30℃、 振荡速度为120r/min时摇瓶浸出25d。 实验过程中采用1∶1的硫酸调节pH值, 用蒸馏水补充所蒸发的水分。 定时取样用原子吸收仪测定分析溶液中的铜离子浓度。

1.5 氧化亚铁硫杆菌对Cu²⁺的吸收^[17]

取对数后期野生菌和驯化菌菌液, 离心收集菌体, 清洗后分别悬浮于Cu²⁺浓度为10、 20、 30、 40、 50g/L的9K液体中(要求细胞浓度为3~4g/L protein, 于30℃恒温振荡培养。 每隔10min, 取一次样, 2h完成反应。 离心收集菌体, 并采用原子吸收法测细胞中的Cu²⁺浓度^[18]。

1.6 氧化亚铁硫杆菌细胞膜囊对Cu²⁺运输的影响^[19]

取对数后期野生菌和驯化菌菌液, 离心收集菌体, 清洗后悬浮于CT缓冲液(100mmol/L Tris-Cl, 150mmol/L KCl, 50mmol/L NaCl, 5mmol/L MgSO₄, pH=6.5)中, 破碎细胞, 离心2h(4×10⁴ r/min, 10℃)收集细胞膜囊。 将膜沉淀悬浮于同样缓冲液中, 采用同样的方法清洗, 离心收集悬浮于CT缓冲液中(含5g/L Cu²⁺), 并使最终蛋白浓度达到3~4g/L。 将细胞悬液于37℃恒温振荡培养30min预处理后, 加入0.5mmol/L的ATP, 启动运输。 每隔10min, 取一次样, 40min完成反应, 采用原子吸收法测处理液中Cu²⁺浓度。

蛋白质标准曲线制作及测定按照Bradford的考马斯亮蓝G250法^[20]。

数据采用平均数±标准差, 每组平行3个样品, 应用origin软件进行分析。

2 结果和分析

2.1 浸矿菌株的驯化培养

细菌依赖一定的环境而生存, 改变一种细菌已适应的环境, 会给细菌的生长带来不利影响, 过分改变环境因素, 就会造成细菌死亡。 与其它生物细胞相比, 细菌对外界环境的变化具有较强的适应能力, 即可通过驯化培养方式使细菌逐步适应严酷的外界环境。

对细菌浸出低品位铜矿石的大量研究及实践表明, Cu²⁺在溶液中的积累对细菌的生长具有较明显的抑制作用。 因此, 在生物浸提中, 提高氧化亚铁硫杆菌对重金属铜的抗性和获得高效金属提取率就显得尤为重要。 本研究采用驯化培养的方法, 对氧化亚铁硫杆菌进行Cu²⁺驯化。 通过比较该菌在不同Cu²⁺浓度下Fe²⁺氧化能力的变化, 观察了氧化亚铁硫杆菌在驯化前后对Cu²⁺的抗性。

表2所列为不同浓度Cu²⁺时氧化亚铁硫杆菌对Fe²⁺氧化能力的变化。 由表2可以看出, 当Cu²⁺浓度超过10g/L时, 氧化亚铁硫杆菌(驯化前)对Fe²⁺氧化能力逐渐受到抑制; 当Cu²⁺浓度为20g/L时, 该菌氧化培养基中全部Fe²⁺氧化所需时间长达264h; 当Cu²⁺浓度为30~40g/L时, 培养基中的Fe²⁺浓度几乎无任何变化。 与驯化前相比, 驯化后氧化亚铁硫杆菌在高浓度Cu²⁺时(Cu²⁺浓度为30~40g/L), 其氧化能力明显提高, 氧化培养基中全部Fe²⁺的氧化所需时间分别为40和48h。 表明该菌经驯化培养后, 对重金属铜的抗性有显著提高, 在Cu²⁺浓度为40g/L时, 可表现出较高的氧化活性。 由此可以说明, 经本研究驯化培养的驯化菌(可拮抗Cu²⁺浓度为40g/L)可作为浸矿菌进行浸矿实验。

表2 不同Cu²⁺浓度时氧化亚铁硫杆菌Fe²⁺氧化能力的变化

Table 2 Changes of ferrous iron oxidation ability by T.f under different Cu²⁺ contents

2.2 Cu²⁺对氧化亚铁硫杆菌氧化活性的影响

通过测定不同Cu²⁺浓度时野生菌和驯化菌氧化培养基中全部Fe²⁺氧化所需时间, 观察了Cu²⁺对氧化亚铁硫杆菌氧化活性的影响, 并研究该菌对重金属铜的抗性, 结果如图1和2所示。 由图1和2可看出, 野生菌在不含Cu²⁺培养基中, 其完全氧化培养基中的Fe²⁺所需时间(t_ox)为28h, 在Cu²⁺浓度为10g/L的培养基中, t_ox为44h。 与不含铜的培养基相比, 在Cu²⁺浓度为20g/L的培养基中, 该菌的Fe²⁺氧化活性明显降低, 停滞期延长, 细菌经过180h后, 才进入快速氧化阶段, t_ox增加到264h; 而在Cu²⁺浓度为30和40g/L的培养基中, 培养基中的Fe²⁺浓度几乎没有任何变化。 这一结果表明, Cu²⁺浓度对野生菌Fe²⁺的氧化活性影响较大, 当Cu²⁺浓度高于10g/L时, 细菌Fe²⁺氧化活性逐渐降低直至完全抑制。 与野生菌相比, 驯化菌在Cu²⁺浓度为20和40g/L培养基中, 其Fe²⁺氧化活性明显提高, 完全氧化培养基中的Fe²⁺所需时间分别为33和48h。 说明氧化亚铁硫杆菌经驯化培养后, 可诱导产生良好的抗铜特性。

图1 Cu²⁺浓度对野生菌Fe²⁺氧化活性的影响

Fig.1 Effect of Cu²⁺ concentration on ferrous ion oxidation by wide T.f

图2 Cu²⁺浓度对野生菌和驯化菌 Fe²⁺氧化活性的影响

Fig.2 Effect of Cu²⁺ concentration on ferrous ion oxidation by

wide T.f and adapted T.f

野生菌和驯化菌的浸出时间对浸出率的影响如图3所示。 由图3可看出, 在无菌酸体系中, 矿石的氧化率要比加菌时低得多, 浸出25d后, 其浸出率只有4.53%, 远远低于有菌体系对硫化铜矿的浸出; 驯化后的菌株对矿石的浸出率达到了23.438%比野生菌株对铜矿的浸出率的17.888%升高了许多。 其生长特性也得到很大的提高, 主要表现为两个方面: 1) 延滞期大大缩短, 菌株很快就能适应环境; 2) Fe²⁺的氧化速率也有很大的提高。 说明氧化亚铁硫杆菌经驯化培养后, 可诱导产生良好的抗铜特性, 浸矿菌株的驯化对细菌对硫化铜矿的浸出是至关重要的。

2.3 氧化亚铁硫杆菌对Cu²⁺的吸收

为了研究氧化亚铁硫杆菌对重金属铜的抗性机制, 采用原子吸收法测定不同Cu²⁺浓度下Cu²⁺在氧化亚铁硫杆菌(野生菌和驯化菌)细胞中的累积量, 观察了氧化亚铁硫杆菌对Cu²⁺的吸收, 结果如图4和5所示。

图3 野生菌和驯化菌的浸出时间对浸出率的影响

Fig.3 Effect of leaching time of wide T.f and adapted T.f on leaching rate

图4 不同Cu²⁺浓度时野生菌对Cu²⁺的吸收

Fig.4 Cu²⁺uptake by wide T.f at different Cu²⁺ concentrations

从图4和5可知, 在最初的30min内, 随着反应的进行, 无论是野生菌还是驯化菌, 其对Cu²⁺的吸收都迅速增加; 30min后, 反应逐渐趋于平衡, 细胞中Cu²⁺含量不再呈显著增加, 120min反应结束。

比较Cu²⁺在野生菌和驯化菌细胞中的含量(见图6)可以明显地看出, 当反应液中的Cu²⁺含量低于20g/L时, 驯化菌细胞中的Cu²⁺含量呈缓慢上升趋势, 与野生菌相比, 驯化菌细胞中Cu²⁺含量始终低于野生菌, 但是差别不是很明显; 当反应液中的Cu²⁺达到20g/L时, 野生菌细胞中的Cu²⁺含量大约驯化菌细胞中的1.191倍; 但当反应液中的Cu²⁺含量高于20g/L时, 野生菌对Cu²⁺的吸收能力远远大于驯化菌; 野生菌细胞中的Cu²⁺含量明显的高于驯化菌, 当反应液中的Cu²⁺达到50g/L时, 野生菌细胞中的Cu²⁺浓度达27.45mg/g时, 含量大约是驯化菌细胞中的1.715倍, 表明此时驯化菌有可能或者通过减少对Cu²⁺的摄入或者通过增加对Cu²⁺的排放, 来调节胞内重金属铜的浓度。

图5 不同Cu²⁺浓度时驯化菌对Cu²⁺的吸收

Fig.5 Cu²⁺uptake by adapted T.f at different Cu²⁺ concentrations

图6 不同Cu²⁺浓度时野生菌和驯化菌对Cu²⁺吸收的比较

Fig.6 Comparison of Cu²⁺ uptake by wide T.f and adapted T.f

at different Cu²⁺ concentrations

2.4 氧化亚铁硫杆菌细胞外翻膜囊对Cu²⁺的运输

为进一步研究氧化亚铁硫杆菌对重金属铜的抗性机制, 本研究仍采用原子吸收法, 通过测定反应液中Cu²⁺浓度的变化来观察氧化亚铁硫杆菌细胞膜囊对Cu²⁺的运输情况, 以确定氧化亚铁硫杆菌对Cu²⁺抗性机制。 自然形成的细胞膜囊是研究物质运输的良好介质, 只有外翻形成的膜囊(其上附有ATPase)才会对反应液中加入的ATP产生反应^{[19, 21-23]}。 因此, 本研究所示细胞膜囊对Cu²⁺的运输, 均为细胞外翻膜囊对Cu²⁺的运输。 图7所示为在ATP刺激下, 细胞外翻膜囊对Cu²⁺的运输。

图7 细胞膜囊对Cu²⁺的运输

Fig.7 Cu²⁺ transportation by native inside-out membrane vesicles of

wide T.f and adapted T.f

实验结果表明, 在相同初始条件下, 加入0.5mmol/L ATP启动反应40min后, 驯化菌外翻膜囊对Cu²⁺的运输浓度为54.91mg/g, 远远高于野生菌外翻膜囊对Cu²⁺的运输(25.24mg/g)。 表明经驯化培养后的细菌与野生菌相比, 具有更高的促进体内Cu²⁺的排出能力, 驯化菌大约是野生菌的2.176倍。 为了说明驯化菌对Cu²⁺的运输是一种依赖于ATP提供能量的主动运输过程, 因而在相同条件下, 在驯化菌外翻膜囊对Cu²⁺的运输反应体系中分别加入0.5mmol/L ATP、 1mmol/L钒酸钠(ATPase抑制剂)及不加ATP, 观察驯化菌菌外翻膜囊的Cu²⁺运输, 结果如图8所示。

图8 驯化菌细胞膜囊对Cu²⁺的运输

Fig.8 Cu²⁺ transportation by adapted T.f native inside-out membrane vesicles

由此可以看出, ATP的加入与否会极大影响驯化菌外翻膜囊对Cu²⁺的运输。 在反应过程中, 不加ATP的反应对Cu²⁺的运输一直处于较低水平, 反应40min后, 其对Cu²⁺的运输最低, 只为10.771mg/g, 表明驯化菌对Cu²⁺的排出需要ATP提供能量。 同样, 在反应体系中加入1mmol/L钒酸钠, 也使驯化菌外翻膜囊对Cu²⁺的运输受到影响, 反应结束后, 其对Cu²⁺运输略高于不加ATP的反应, 这可能是由于驯化菌对Cu²⁺的排出系统除了依赖ATPase的主动运输外, 还存在另外的非特异性运输, 或者是由于膜囊吸附了一部分Cu²⁺所致。

3 讨论

3.1 Cu²⁺对氧化亚铁硫杆菌Fe²⁺氧化活性的影响

本研究观察了Cu²⁺对氧化亚铁硫杆菌(野生菌及驯化菌)Fe²⁺氧化活性的影响, 结果显示, Cu²⁺对野生菌Fe²⁺氧化活性影响较大, 随着培养基中Cu²⁺浓度的增加, Cu²⁺对细胞造成的毒害也越来越严重。 与野生菌相比, 在高Cu²⁺培养基中(浓度为40g/L), 驯化菌则表现出较高的氧化活性, 其Fe²⁺氧化速率最高可达334mg/(L·h)。 表明氧化亚铁硫杆菌经驯化培养后, 可诱导产生良好的抗铜特性, 经本研究驯化培养后, 该驯化菌可拮抗的Cu²⁺浓度为40g/L。 这些结果和前人的研究结果基本一致^[5-6], 即通过驯化后, 氧化亚铁硫杆菌对多种重金属均可获得良好的抗性作用。

3.2 氧化亚铁硫杆菌对Cu²⁺的吸收

本研究通过观察氧化亚铁硫杆菌对Cu²⁺的吸收, 发现反应30min后, 氧化亚铁硫杆菌对Cu²⁺的吸收逐渐趋于平衡, 细胞中Cu²⁺含量不再呈显著增加。 比较Cu²⁺在野生菌和驯化菌细胞中的含量可以明显看出, 与野生菌相比, Cu²⁺在驯化菌细胞中的含量呈缓慢上升趋势且总是低于野生菌细胞中Cu²⁺含量, 这与Agnes等^[17]在研究氧化亚铁硫杆菌野生菌与驯化菌对Cu²⁺的吸收实验所得结果基本一致。 同时在本研究中, 可明显观察到当反应液中Cu²⁺含量高于20g/L(该浓度下野生菌氧化活性明显降低), 野生菌细胞中的Cu²⁺含量则明显的高于驯化菌, 并随着反应液中Cu²⁺含量的增加, 增高的趋势也越来越明显, 表明此时驯化菌有可能通过减少对Cu²⁺的摄入以及增加对Cu²⁺的排放, 来调节胞内重金属铜的浓度。

3.3 氧化亚铁硫杆菌对Cu²⁺的排出

为进一步确定氧化亚铁硫杆菌对Cu²⁺抗性机制究竟是增加细胞内Cu²⁺的排出还是大量减少Cu²⁺的摄入, 实验中观察了外翻膜囊对Cu²⁺的运输。 结果表明, 在ATP的作用下, 反应40min后, 驯化菌外翻膜囊对Cu²⁺的运输为54.91mg/g, 驯化菌外翻膜囊对Cu²⁺的运输远远高于野生菌。 由此说明, 经驯化培养后的细菌与野生菌相比, 具有更高的促进体内Cu²⁺排出的能力, 驯化菌大约为野生菌的2.176倍, 该排出能力需ATP提供能量, 是一种主动运输过程。 对照驯化菌和野生菌对铜离子的吸收: 当反应液中Cu²⁺达到50g/L时, 野生菌细胞内的Cu²⁺浓度27.45mg/g, 而驯化菌细胞内Cu²⁺浓度16.58mg/g。 可明显看出, 氧化亚铁硫杆菌为了维持细胞内的铜离子浓度, 采用的主要方式是增加细胞内Cu²⁺的排出, 从而也就说明氧化亚铁硫杆菌对Cu²⁺抗性机制主要是增加细胞内Cu²⁺的排出而非大量减少Cu²⁺的摄入。

4 结论

1) 在一定的浓度范围内, 逐步增加铜离子的浓度, 可诱导氧化亚铁硫杆菌对铜离子产生抗性, 驯化菌株与野生菌株相比, 表现出良好的抗铜能力。

2) 驯化菌对付高浓度铜离子胁迫的手段有两类: 1) 通过减少对铜离子的吸收来抵抗高浓度铜离子胁迫; 2) 通过增加细胞内Cu²⁺的排出来抵抗高浓度铜离子胁迫。

3) 驯化菌通过增加细胞内Cu²⁺的排出来抵抗高浓度铜离子胁迫的能力要远远高于其通过减少对铜离子的吸收来抵抗高浓度铜离子胁迫的能力。

4) 在高浓度Cu²⁺诱导下, 驯化菌株通过建立依赖ATPase的阳离子外流系统来增加细胞内铜的排放从而控制胞内铜离子的浓度。

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基金项目: 甘肃省科技攻关基金资助项目(2GS035-A52-008-01); 兰州市科技攻关资助项目(03-02-24)

收稿日期: 2004-10-10; 修订日期: 2005-10-08

作者简介: 姚 静(1973-), 女, 硕士研究生

通讯作者: 李红玉, 博士, 教授; 电话: 13519640428, 传真: 0931-8912561; E-mail: lihy@lzu.edu.cn

(编辑李艳红)