γ-环糊精-达旦黄包合物与鲱鱼精DNA的作用机理

费  丹¹，王兴明¹，阮开敏¹，于婷婷¹，欧阳昌伟¹，

赵学全¹，刘胜男¹，戴亚堂¹，董发勤¹，丁立生²

(1. 西南科技大学 材料科学与工程学院，四川 绵阳，621010；

2. 中国科学院 成都生物研究所，四川 成都，610041)

摘  要：在生理pH=7.4环境下，用摩尔比法测定γ-环糊精(γ-CD)与达旦黄(TY)的包合比(摩尔比)n_γ-CD?n_TY =1?1，直线法测定包合常数K_f = 495.23 L/mol。以中性红(NR)作分子探针，用紫外光谱法、荧光光谱法、电化学法、化学热力学法和黏度法等研究包合物γ-CD-TY与鲱鱼精DNA的作用，得到γ-CD-TY包合物与鲱鱼精DNA作用的结合比n_γ-CD-TY?n_DNA=6?1，结合常数为=1.12×10⁵ L/mol，=2.72×10⁵ L/mol。热力学函数=-2.82×10⁴ J/mol，=5.67×10⁴ J/mol，=284.78 J/(mol·K)，说明γ-CD-TY包合物与DNA作用为熵驱动。确定γ-CD-TY与鲱鱼精DNA的作用方式为混合作用，同时存在部分嵌插和非嵌插作用方式。

关键词：γ-环糊精；达旦黄；包合物；鲱鱼精DNA；作用方式⊙

中图分类号：O629.74          文献标识码：A         文章编号：1672-7207(2009)02-0367-08

Functionary mechanism between inclusion complex of titan yellow with γ-cyclodextrin and herring sperm DNA

FEI Dan¹, WANG Xing-ming¹, RUAN Kai-min¹, YU Ting-ting¹, OUYANG Chang-wei¹,

ZHAO Xue-quan¹, LIU Sheng-nan¹, DAI Ya-tang¹, DONG Fa-qin¹, DING Li-sheng²

(1. School of Materials Science and Engineering, Southwest University of Science and Technology,

 Mianyang 621010, China;

2. Chengdu Institute of Biology, Chinese Academy of Sciences, Chengdu 610041, China)

Abstract: Under the condition of physiological environment pH 7.4, the binding ratio n_γ-CD?n_TY=1?1 and binding constant K_f = 495.23 L/mol were confirmed by mole ratio method and linear method. NR was used as molecule probe, and the interaction between γ-CD-TY and herring-sperm DNA was studied by UV spectra, fluorescence spectra, electrochemistry, thermodynamic method and viscosity method, etc. A series of thermodynamic functions such as =-2.82×10⁴ J/mol, =5.67×10⁴ J/mol, =284.78 J/(mol·K) were obtained, and  is the primary driven power of this interaction, the binding ratio is n_γ-CD-TY?n_DNA=6?1, the binding constants are =1.12×10⁵ L/mol, =   2.72×10⁵ L/mol. The interaction mode between γ-CD-TY and herring-sperm DNA is a mixed binding, consisting of partly intercalation and dis-intercalation.

Key words: γ- cyclodextrin; titan yellow; inclusion complex; herring-sperm DNA; interaction mode

超分子化学是一门迅速发展起来的新兴学科，超分子作用是一种具有分子识别能力的非共价键分子间作用力。环糊精(Cyclodextrin，简称CD)，是一种重要的超分子主体，是由环糊精葡萄糖基转移酶(CGT)作用于淀粉所产生的，由D(+)-葡萄糖单元通过α-(1, 4)糖苷键连接起来的环状寡糖。环糊精分子中包含众多化学反应性相同的羟基，这些可修饰和可生成氢键的基团与邻近的疏水空腔共存，可以包合各种有机、无机客体，还可以表现出特殊的吸附性能^[1]，因而可以进行各种模型设计。这种包合作用能明显改善客体分子的状态、稳定性、溶解度等理化特性^[2-3]。在医药方面，环糊精可促进药物稳定性，增加药物溶解度，提高药物生物利用度，作为药物缓释剂^[4]。目前，有关金属配合物用于抗肿瘤药物、DNA探针、荧光免疫分析等领域的研究较多^[5]，而关于环糊精超分子包合物与DNA之间作用机理的研究还比较少。本实验模拟人体生理pH值，用γ-环糊精包合一种常用的血液离子诊断用药——达旦黄(Titan yellow，简称TY)。用UV-Vis、荧光光谱和热力学等多种方法研究γ-环糊精-达旦黄二元包合物与鲱鱼精DNA的相互作用，探讨其作用方式，得到了一系列有价值信息。此外，传统的光谱探针EB具有强烈的致癌性，且放置不稳定，实验废水难处理，易污染环境。本实验中采用相对环保，弱毒性，且对DNA有专一嵌插作用^[6-7]的新一代光谱探针中性红(Natrure red，简称NR)进行相关研究。

1  实  验

1.1  试剂和仪器

试剂为：鲱鱼精DNA (A.R，Sigma公司生产)；达旦黄(TY，A.R，上海化学试剂厂生产)；γ-环糊精(γ-CD，A.R，成都科龙化工试剂厂生产)；中性红(NR，A.R，成都科龙化工试剂厂生产)；三羟甲基氨基甲烷(A.R，天津科密欧化学试剂开发中心生产)；Tris (0.05 mol/L)-HCl 缓冲溶液，为临时配制；其他试剂均为分析纯，水为二次重蒸水。

仪器为：UV-3400分光光度计(日本日立)；RF-540 荧光仪(日本岛津)；CHI 760C型电化学工作站(CH Instruments， USA)；三电极系统：以玻碳电极(GCE，d 0.03 cm)为工作电极，Ag/AgCl电极为参比电极，铂片电极作对电极；pHS-2C型酸度计(成都方舟科技开发公司制造)；恒温水浴槽(成都方舟科技开发公司制造)；乌贝路德黏度计。

1.2  实验方法

1.2.1  紫外光谱法

使用Tris-HCl缓冲溶液(pH=7.4)为作用介质，配制好待测包合物溶液，静置5 min。用1 cm比色皿，在参比池加入3.00 mL 空白试剂，在样品池中加入3.00 mL待测溶液，以试剂空白作参比，扫描吸收光谱。然后，向两池中每次分别依次加入0.01 mL DNA溶液，充分搅拌，混合均匀，使DNA和包合物的浓度比不断增加，同时，扫描吸收光谱。

1.2.2  荧光光谱法

在1 cm比色皿中加入3.00 mL待测包合物溶液，放入样品池中，扫描发射光谱。然后，向样品池每次加入0.01 mL DNA溶液，充分搅拌，使DNA和包合物的浓度比不断增加，扫描发射光谱。荧光激发波长为412 nm。

1.2.3  电化学法

对电极进行预处理。将玻碳电极在麂皮上依次用Al₂O₃的悬浊液抛光，然后，用蒸馏水在超声波清洗仪中清洗干净。配制不同摩尔比的DNA和γ-CD-TY包合物溶液，定容，摇匀，在CHI 760C型电化学工作站上以0.05 V/s的扫描速度记录-0.1~0.8 V的循环伏安曲线。

三电极系统：工作电极为碳纳米管修饰玻碳电极(GCE)；参比电极为饱和甘汞电极(SCE)；对电极为铂丝电极。

1.2.4 黏度法

用Tris-HCl缓冲溶液配制NR-DNA 和γ-CD-TY包合物-DNA溶液，放置 24 h，在297.15 K恒温水浴槽中用乌贝路德黏度计测其黏度。

2  结果与讨论

2.1  γ-环糊精与达旦黄的包合作用及包合比的确定

γ-环糊精结构如同一个中空的圆台面，内径为0.78~0.83 nm，高为0.79 nm。内侧的糖苷键上的氧原子处于—CH键屏蔽下，有疏水作用，而外腔却具有很多亲水作用的羟基。从TY分子(如图1所示)结构看，TY分子是有3个苯环结构的化合物，形成3个p-π共轭体系，理论上这类基团易被CD环包合。紫外光谱法是研究环糊精与有机客体之间相互作用最常用的方法。当客体与环糊精的包合物形成时，由于其富电子基团会全部或部分嵌入环糊精分子空腔中，环糊精分子腔中的高电子密度诱导客体分子电子发生转移，所以，最大吸收峰的位置、强度或者峰形会发生某些变化^[8]。单独的TY分别在波长为322 nm和400 nm处存在紫外吸收峰，随着 γ-CD 的不断加入，在低浓度时(图2(a))，体系的紫外吸收强度呈规律性地上升；在高浓度时(图2(b))，体系的紫外吸收强度呈规律性地下降；而这2种情况都同时伴随着紫外吸收峰的红移，由400 nm移至410 nm。该现象说明TY客体所在的化学微环境随着主体γ-CD 的加入而发生变化，即由极性环境进入到环糊精疏水空腔的非极性环境而形成了包合物。

图1  达旦黄分子结构

Fig.1  Molecule structure of titan yellow

c_TY = 1.00×10^-5 mol/L

(a) 1—c_γ-CD=0; 2—c_γ-CD=0.50×10^-5 mol/L;

3—c_γ-CD=1.00×10^-5 mol/L; 4—c_γ-CD=1.50×10^-5 mol/L;

5—c_γ-CD=2.00×10^-5 mol/L

(b) 1—c_γ-CD=0; 2—c_γ-CD=1.00×10^-5 mol/L;

3—c_γ-CD=2.00×10^-5 mol/L; 4—c_γ-CD=3.00×10^-5 mol/L;

 5—c_γ-CD=4.00×10^-5 mol/L

图2  γ-CD对TY吸收光谱的影响

Fig.2  Effects of γ-CD on absorption spectra of TY

固定TY浓度，改变γ-CD浓度，在波长为412 nm时平行测定吸光度，根据摩尔比法作图，结果如图3 所示。测得γ-CD与TY的包合比(摩尔比)为 n_γ-CD?n_TY=1?1。根据Benesi-Hildebrand观点^[9]，如果γ-CD与TY形成摩尔比为1?1包合物，在[CD]＞[TY]的情况下，TY吸收强度的变化值ΔA与γ-CD浓度的关系式为1/ΔA = 1/(A₀-A) = [1/(α·K_f)]·(1/c_γ-CD)+(1/α)·c_TY

式中：A₀和A分别为γ-CD存在和不存在时溶液的吸光强度；α为常数；c_γ-CD为 γ-CD的浓度；K_f为包合常数。

c_TY = 1.00×10^-5 mol/L

图3  在波长为412 nm时TY-γ-CD的浓度比

Fig.3  Mole ratio plots of TY-γ-CD at 412 nm

因此，若以1/c_γ-CD对1/ΔA作图为直线，表明主、客体形成1?1包合物。由图4可见，1/c_γ-CD与1/ΔA呈线性关系，表明γ-CD与TY形成1?1包合物。由上式和图4计算得到包合常数K_f = 495.23 L/mol。

c_TY = 1.00×10^-5 mol/L

图4  γ-CD-TY的双倒数曲线(405 nm)

Fig.4  Double reciprocal curve of γ-CD-TY

2.2  包合物与DNA的相互作用

2.2.1  紫外-可见光谱法

向γ-CD-TY包合物溶液中等量滴加DNA溶液，扫描γ-CD-TY与DNA体系的紫外光谱。通过实验发现，单独的DNA溶液在波长为400~800 nm的可见区吸光度为0，但当DNA加入到γ-CD-TY溶液中后，却使得γ-CD-TY的吸光度在350~500 nm范围内有规律地逐渐上升。此现象表明，包合物与DNA之间不是发生简单的吸光度加合现象，而是生成了新物质。根据文献报道^[10]，当小分子以嵌入方式结合于DNA双螺旋碱基对之间时，其吸收光谱表现出减色效应；当小分子以静电方式结合于DNA时，其吸收光谱表现出增色效应。因此，γ-CD-TY与DNA之间存在一定的静电作用。为了进一步定量分析包合物与DNA作用，通过摩尔比法在410 nm处作图(图5)得到包合物与DNA的结合比：n_γ-CD-TY?n_DNA=6?1。根据Lambert-Beer 定律：

得到包合物-DNA 的摩尔吸光系数：

ε = A/(bc)=2.53×10⁵ L/(mol?cm)。

式中：A为包合物与DNA结合达饱和后的吸光度；ε为包合物-DNA 的摩尔吸光系数；c为包合物-DNA浓度；即结合形成此复合物的DNA 的浓度；b为比色皿厚度。

c_γ-CD-TY =1.00×10^-5 mol/L

图5  在波长为410 nm时DNA-γ-CD-TY包合物的浓度比

Fig.5  Molar ratio plots of DNA-γ-CD-TY at 410 nm

采用热力学方法分析γ-CD-TY与DNA的相互作用，可以更深刻地理解它们的作用方式。分别在298.15 K和人体温度310.15 K下测定DNA对γ-CD-TY包合物的作用，并作出双倒数图(图6)。根据双倒数公式^[11]：

得到γ-CD-TY与DNA结合常数为=1.12×10⁵  L/mol，=2.72×10⁵ L/mol。式中：A₀和A分别为加入DNA前后包合物的吸光度；K为结合常数。再联用公式：

；     (1)

；             (2)

。           (3)

得到=5.67×10⁴ J/mol，为正值，说明反应吸热，温度升高有利于反应的进行；=-2.82×10⁴ J/mol，推测γ-CD-TY包合物与DNA的相互作用有自发进行的可能；=284.78 J/(mol?K)，由此可知，γ-CD-TY包合物与DNA的相互作用为熵所驱动。

c_γ-CD-TY =1.00×10^-5 mol/L

图6  波长为260 nm时DNA对γ-CD-TY的双倒数曲线

Fig.6  Double reciprocal curves of DNA to γ-CD-TY at 260 nm

吩嗪染料中性红(NR)可与DNA发生嵌插作用，因此，可用作分子探针研究包合物与 DNA的作用方式。向NR中加入DNA溶液的电子吸收光谱表明，NR 与DNA 的嵌插作用对应于NR 在453 nm 的吸光度降低和537 nm吸光度升高并红移(图7)。按照1?1的比例配制NR-DNA的混合溶液，静置，待反应完全，在NR-DNA的混合溶液系统中滴加γ-CD-TY包合物溶液(图8)，随着γ-CD-TY的加入，NR 在407 nm 的吸光度明显升高，弱峰变强峰。造成这种变化的原因，一方面是γ-CD-TY在该波长范围内与NR-DNA混合体系出现吸光度加合作用；另一方面，也可能是γ-CD-TY与NR之间嵌插竞争作用，使得一部分NR小分子从DNA 中游离出来，而引起该波长范围内吸光度增加。同时，原本在553 nm处无吸收的γ-CD-TY包合物，却引起NR-DNA混合溶液系统在该波长范围内吸光度有规律性地微量增加，这证明了嵌插竞争作用的存在。不过该增加值相当微弱，这是由于γ-CD的超分子包裹作用，使得客体分子TY与DNA间的嵌插作用相当微弱。

c_NR =1.00×10^-5 mol/L

1—c_DNA=0; 2—c_DNA=0.20×10^-5 mol/L;

3—c_DNA=0.40×10^-5 mol/L; 4—c_DNA=0.60×10^-5 mol/L;

5—c_DNA=0.80×10^-5 mol/L; 6—c_DNA=1.00×10^-5 mol/L;

7—c_DNA=1.20×10^-5 mol/L

图7   DNA对NR吸收光谱的影响

Fig.7  Effects of absorption spectra of DNA on NR

c_DNA-NR=0.20×10^-6 mol/L

1—c_γ-CD-TY=0; 2—c_γ-CD-TY=0.10×10^-5 mol/L;

3—c_γ-CD-TY=0.20×10^-5 mol/L; 4—c_γ-CD-TY=0.30×10^-5 mol/L;

5—c_γ-CD-TY=0.40×10^-5 mol/L; 6—c_γ-CD-TY=0.50×10^-5 mol/L;

7—c_γ-CD-TY=1.20×10^-5 mol/L

图8  γ-CD-TY对DNA-NR吸收光谱的影响

Fig.8  Effects of absorption spectra of γ-CD-TY on DNA-NR

2.2.2  荧光光谱法

向γ-CD-TY包合物中等量滴加DNA溶液，通过扫描得到的荧光发射光谱如图9所示。结果表明，随着 DNA的加入γ-CD-TY包合物的发射峰发生了部分猝灭，并且在526 nm处出现了1个等荧光强度点。这是因为包合物与DNA作用后，包合物与DNA之间可能存在微弱的嵌插作用，部分插入DNA碱基对中，因而受到DNA的保护，使之免受水分子的猝灭，因此，一部分荧光强度增加。同时，环糊精包合物中的疏水基团受到了DNA分子中疏水基团的吸附，通过氢键或疏水作用结合在 DNA 的沟面，因此，包合物受DNA保护程度不大，出现了部分猝灭现象^[12]。以上荧光强度的改变，证实包合物与DNA之间存在相互作用，但作用程度不大，因此，推测包合物与DNA之间的作用是一种混合作用。

c_γ-CD-TY =0.10×10^-6 mol/L

1—c_DNA= 0; 2—c_DNA= 0.20×10^-7 mol/L;

3—c_DNA= 0.40×10^-7 mol/L

图9  DNA对γ-CD-TY荧光光谱的影响

Fig.9  Effects of emission spectra of DNA on γ-CD-TY

同样，也可用中性红作为荧光探针分子研究γ-CD-TY包合物与DNA的作用方式。当有DNA和γ-CD-TY包合物存在时，NR的荧光强度会大大增强，当加入同样对DNA具有嵌插作用的药物分子时，会使DNA-NR混合溶液发生荧光猝灭现象^[6]。而向NR-DNA的混合溶液系统中加入γ-CD-TY包合物溶液，并没有观察到荧光猝灭现象，说明包合物与DNA之间的嵌插作用不存在或十分微弱，包合物与DNA之间可能存在静电方式或沟结合等非嵌插作用方式。

用经典的Scatchard 法研究γ-CD-TY包合物与DNA的作用方式， γ-CD-TY与 NR-DNA相互作用的 Scatchard 图如图10所示。NR与DNA作用的特点可用Scatchard方程阐述^[13]：

r/c＝K(n-r)。

式中：r为每个核苷酸结合NR的分子数；c为NR游离浓度；n为r的最大值；K为单个位点固有的结合   常数。

R_t＝c_γ-CD-TY/c_DNA

R_t: 1—0; 2—2; 3—4; 4—6

图10  γ-CD-TY与 NR-DNA作用的 Scatchard 曲线

Fig.10  Scatchard plots of interaction between γ-CD-TY and NR-DNA

γ-CD-TY包合物与NR-DNA 混合溶液的Scatchard方程如表１所示。若包合物存在与不存在时NR的Scatchard图有相同的n，则包合物与DNA的作用方式为嵌插方式；若与NR的Scatchard图有相同的K，则包合物与DNA的作用为非嵌插方式；若该直线与NR的Scatchard图中的K和n均不同，则包合物与DNA的作用为混合方式^[14]。表１中，γ-CD-TY与DNA作用的K和n均不同，表明它们之间为混合作用方式，即同时存在嵌插作用和非嵌插作用。

表1  包合物γ-CD-TY与鲱鱼精DNA的相互作用的Scatchard方程

Table 1  Data of Scatchard Equation of interaction between γ-CD-TYand DNA

2.3  电化学方法

天然DNA分子，其碱基的电还原活性位点深藏于双螺旋中，一般不能参与电极过程。而变性后的单链DNA分子的碱基虽然能发生化学还原和氧化，但还原电位较负(＜-1.20 V (vs.SCE))^[15]。采用循环伏安法研究了小分子与DNA的作用方式，认为峰电位正移则表明小分子与DNA为疏水的相互作用即嵌入结合，而峰电位负移时小分子与DNA之间的作用为静电作用^[16]。以玻碳电极为工作电极，以pH=7.40的Tris-HCl缓冲溶液为支持电解质，在-0.50~-1.20 V电位窗口内以0.05 V/s的扫描速度对γ-CD-TY在有或无DNA存在时进行循环伏安(CV)测试，得到其循环伏安曲线，见图11。可见，在不存在DNA时，包合物的还原峰为-0.993 V，为不可逆电化学还原过程。由于峰电位易受到空气中氧气峰电流位置(约为-0.800 V)

的影响，在实验过程中每次测试均先通入10 min氮气。实验结果表明，当体系中加入DNA后，峰电流增加，峰电位负移至-0.998 V，证明DNA与包合物之间存在静电作用。同样，在-0.90~-1.10 V电位窗口范围进行微分脉冲伏安(DPV)测试，得到其微分脉冲伏安曲线，见图12。得到的结果与采用循环伏安法所得结果相同，包合物的峰电流增加，峰电位负移了0.022 V，由-0.958 V移动到-0.980 V。

c_γ-CD-TY=1.00×10^-4 mol/L

1—c_DNA=0; 2—c_DNA=0.05×10^-4 mol/L;

3—c_DNA=0.10×10^-4 mol/L

图11  DNA对γ-CD-TY循环伏安曲线的影响

Fig.11  Effects of cyclic voltammograms of DNA on γ-CD-TY

c_γ-CD-TY=0.50×10^-4 mol/L

1—c_DNA=0; 2—c_DNA=0.25×10^-6 mol/L;

3—c_DNA=0.50×10^-6 mol/L; 4—c_DNA=0.75×10^-6 mol/L;

5—c_DNA=1.00×10^-6 mol/L; 6—c_DNA=1.25×10^-6 mol/L

图12  DNA对γ-CD-TY微分脉冲伏安曲线的影响

Fig.12  Effects of differential pulse voltammograms of DNA on γ-CD-TY

2.4　黏度法

黏度法是一种对DNA长度变化敏感的流体力学方法。一般来讲，当小分子配合物以插入模式与DNA作用时，DNA的相邻碱基对的距离会变大以容纳插入配体，因而导致DNA 双螺旋伸长，DNA 溶液的黏度增加；当配合物以静电或沟面结合等非插入模式与DNA作用时，DNA溶液的黏度无明显变化；而以部分插入方式与DNA作用时，则可能使DNA的双螺旋扭结，使其黏度减小^[12]。γ-CD-TY对DNA黏度的影响如图13所示，可见，由于γ-CD的包合作用阻碍了TY的插入，使γ-CD-TY与DNA只有部分插入作用，而且这种嵌插作用是微弱的，因此，表现出黏度减小的现象。

c_DNA=2.00×10^-4 mol/L

图13  γ-CD-TY对DNA 黏度的影响

Fig.13  Effect of viscosity of γ-CD-TY on DNA

3  结  论

a. 通过摩尔比法和直线法，测得γ-CD与TY在生理pH=7.40时形成1?1包合物，结合常数为K_f = 495.23 L/mol。

b. 由热力学实验测定和计算得到γ-CD-TY包合物与鲱鱼精DNA相互作用的结合比(摩尔比)为n_γ-CD-TY?n_DNA= 6?1，结合常数为=1.12×10⁵ L/mol，= 2.72×10⁵ L/mol，=-2.82×10⁴ J/mol，= 5.67×10⁴ J/mol，=284.78 J/(mol?K)，说明γ-CD-TY包合物与鲱鱼精DNA的相互作用为吸热反应，可自发进行，并为所驱动。

c. 荧光光谱、紫外光谱和电化学等多种方法的研究结果表明，该包合物γ-CD-TY与鲱鱼精DNA之间的作用方式是一种以沟槽作用和静电作用为主，嵌插作用为辅的混合作用方式。由于γ-CD通过疏水作用对达旦黄的包合，以及TY分子相对较长(约为21.26×10^{-10 m)}，使得γ-CD-TY包合物中只有处于γ-CD圆筒外的TY分子的端基部分与DNA才有插入作用，即嵌插作用十分微弱。

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收稿日期：2008-02-18；修回日期：2008-06-18

基金项目：国家自然科学基金资助项目(30572254)

通信作者：王兴明(1955-)，男，四川广汉人，教授，从事化学生物学研究；电话：0816-6089371；E-mail: xmwang_xkd@126.com