简介概要

羧甲基纤维素钠对细菌活性及其浸矿性能的影响

来源期刊：稀有金属2018年第11期

论文作者：罗毅温建康武彪

文章页码：1199 - 1209

关键词：羧甲基纤维素钠;菌种驯化;实时荧光定量PCR技术;正交试验;

摘要：羧甲基纤维素钠（CMC-Na）作为一种制粒粘结剂,在低品位矿石生物堆浸中有着潜在的应用价值。作为前期研究工作,主要考查了CMC-Na对细菌氧化活性及其浸矿性能的影响。首先考察了CMC-Na浓度（0～10 g·L-1）、细菌接种量（5%～30%）、初始pH值（1. 2～2. 4）、温度（15～45℃）和Fe2+浓度（3～9 g·L-1）等因素对细菌氧化活性的影响;通过逐步的驯化培养,使细菌的耐受CMC-Na浓度从4 g·L-1达到了10 g·L-1。接着,利用实时荧光定量PCR技术对耐受CMC-Na浓度为0～10 g·L-1的菌液进行了细菌种群结构分析,结果表明菌液中均存在Acidithiobacillus sp.,Leptopirillum sp.,Ferroplasma sp. 3种细菌,其中Acidithiobacillus sp.均为优势菌种;最后通过正交试验L9（34）考查了CMC-Na浓度（2～10 g·L-1）、细菌接种量（10%～30%）、初始p H值（1. 2～2. 4）、矿浆浓度（2%～5%）等因素对低品位矿石生物浸出时浸出率的影响,得出各因素影响的主次顺序为:CMC-Na浓度>细菌接种量>初始p H值>矿浆浓度。

网络首发时间: 2017-03-07 17:42

稀有金属 2018,42(11),1199-1209 DOI:10.13373/j.cnki.cjrm.XY16090022

羧甲基纤维素钠对细菌活性及其浸矿性能的影响

罗毅温建康武彪

北京有色金属研究总院生物冶金国家工程实验室

摘要：

羧甲基纤维素钠 (CMC-Na) 作为一种制粒粘结剂, 在低品位矿石生物堆浸中有着潜在的应用价值。作为前期研究工作, 主要考查了CMC-Na对细菌氧化活性及其浸矿性能的影响。首先考察了CMC-Na浓度 (0～10 g·L-1) 、细菌接种量 (5%～30%) 、初始pH值 (1. 2～2. 4) 、温度 (15～45℃) 和Fe2+浓度 (3～9 g·L-1) 等因素对细菌氧化活性的影响;通过逐步的驯化培养, 使细菌的耐受CMC-Na浓度从4 g·L-1达到了10 g·L-1。接着, 利用实时荧光定量PCR技术对耐受CMC-Na浓度为0～10 g·L-1的菌液进行了细菌种群结构分析, 结果表明菌液中均存在Acidithiobacillus sp., Leptopirillum sp., Ferroplasma sp. 3种细菌, 其中Acidithiobacillus sp.均为优势菌种;最后通过正交试验L9 (34) 考查了CMC-Na浓度 (2～10 g·L-1) 、细菌接种量 (10%～30%) 、初始p H值 (1. 2～2. 4) 、矿浆浓度 (2%～5%) 等因素对低品位矿石生物浸出时浸出率的影响, 得出各因素影响的主次顺序为:CMC-Na浓度>细菌接种量>初始p H值>矿浆浓度。

关键词：

羧甲基纤维素钠;菌种驯化;实时荧光定量PCR技术;正交试验;

中图分类号： TF18

作者简介：罗毅 (1990-) , 男, 湖北广水人, 硕士研究生, 研究方向:生物冶金;E-mail:1056853111@qq.com;;*温建康, 教授级高级工程师;电话:010-82241313;E-mail:kang3412@126.com;

收稿日期：2016-09-18

基金：国家自然科学基金项目 (51574036) 资助;

Activity of Bacteria and Leaching Properties by Sodium Carboxymethyl Cellulose

Luo Yi Wen Jiankang Wu Biao

National Engineering Laboratory of Biohydrometallurgy, General Research Institute for Nonferrous Metals, Beijing

Abstract：

As an agglomeration binder, sodium carboxymethyl cellulose ( CMC-Na) has a potential application prospect in the lowgrade oreheap bioleaching process. The effect of CMC-Na on the oxidation activity and leaching properties of bacteria were mainly studied. Firstly, the affecting parameters, such as CMC-Na concentration ( 0 ～ 10 g·L-1) , inoculation amount of bacteria ( 5%～ 30%) , initial p H value ( 1. 2 ～ 2. 4) , reaction temperature ( 15 ～ 45 ℃) and Fe2 +concentration ( 3 ～ 9 g·L-1) were systemically investigated. Through a gradual domestication of bacteria, itsresistant for CMC-Na concentration was improved obviously from 4 to 10 g·L-1.And then, the real-time fluorescence quantitative PCR technology was employed to identify the community structure of cultured bacterial solution with CMC-Na 0 ～ 10 g·L-1. The analysis results demonstrated that the main compositions of bacteria in these solutions were Acidithiobacillus sp., Leptopirillum sp. and Ferroplasma sp. and the Acidithiobacillus sp. was the dominant bacteria. Finally, the influence of CMC-Na concentration ( 2 ～ 10 g·L-1) , inoculation amount of bacteria ( 10%～ 30%) , initial p H value ( 1. 2 ～ 2. 4) and pulp density ( 2% ～ 5%) on the leaching rate of low-grade ore bioleaching were investigated by orthogonal test L9 ( 34) , and the experimental results revealed that the rank of influence factors was: CMC-Na concentration > inoculation amount of bacteria > initial p H value > pulp density.

Keyword：

sodium carboxymethyl cellulose; domestication; FQ-PCR; orthogonal experiment;

Received： 2016-09-18

随着高品位、易处理矿石资源的不断减少, 同时矿产资源日益贫化和复杂以及环保压力与日剧增 ^[1] , 一些低品位、复杂、难处理矿石的开发与利用成了当务之急。火法工艺存在工艺复杂、生产成本高、环境污染严重等问题 ^[2] , 不适合处理低品位的矿石;堆浸工艺因为其流程短、工序少、投资和生产成本低、建设周期短、物耗低、环境污染小等优点 ^[3] , 广泛用于从低品位矿石 (<0.6% (质量分数) ) 中回收铜、镍、金、铀、银等有价金属 ^[4,5] , 尤其生物堆浸工艺成为近年来低品位铜、铀、镍矿浸出研究的热点 ^[6,7] 。

矿石在开采和破碎过程中不可避免会产生大量的粉矿。含粉矿的矿石实际堆浸过程中, 由于筑堆时存在粗细粒级粒度偏析现象、喷淋时矿堆中细颗粒矿粉随喷淋液发生迁移堵塞矿堆、Ca, Mg, Al等碱性物质与硫酸反应导致矿堆结垢并堵塞浸出液流通的通道, 最终导致矿堆表面积水或形成沟流, 堆浸渗透性差以及有价金属的浸出率低 ^[3,8] 。采用制粒技术是改善堆浸渗透性的有效措施之一, 其主要目的一是制粒过程中预先加入浸出剂与矿石发生反应, 可以加快浸出过程、缩短浸出周期, 同时与矿石中的碱性脉石矿物反应, 防止结垢的发生;二是通过制粒将细粒级的粉矿颗粒形成较大的球团, 可以显著提高矿石本身和矿堆的渗透性, 也可以避免筑堆时的粒度偏析现象 ^[9] 。

选择合适的粘结剂是制粒技术成功的关键因素之一, 选择的粘结剂应满足 ^[10] :具有较高的粘性, 使矿石成球后具有足够的湿强度, 但不能在粒团的表面形成致密的覆盖层;价格低廉, 货源稳定;粘结剂的添加简单易行, 并尽可能实现自动化;粘结剂不能与矿石中的物质形成其他物质进入溶液, 以免影响浸出效果或是不利于后续浸出液的回收。通常铜、铀、镍矿的浸出是在酸性条件下进行的, 选择的粘结剂也要承受酸性环境。国内外研究者试验了很多耐酸的粘结剂, 其中实际应用效果较好的粘结剂有聚丙烯酰胺 (polyacrylamide) ^[11] , 高油沥青 (tall oil pitch) ^[11] , 聚醋酸乙烯酯乳液 (polyvinyl acetate emulsion) ^[11] , 废弃物添加剂 (waste treatment additive) ^[11] , CaSO₄·1/2H₂O ^[12] , N602 ^[13] , N603 ^[14] 、羧甲基纤维素+淀粉+膨润土+石灰石 (复合粘结剂) ^[15] 等, 但目前鲜有耐酸制粒粘结剂推广到工业应用的报道。

羧甲基纤维素钠 (CMC-Na) 具有独特的粘合性、增稠性、悬浮性和水分保持性等特性, 被广泛应用于食品、医药、化妆品、涂料、油漆、纺织、石油和造纸等行业 ^[16] 。羧甲基纤维素钠溶于水后能形成一定粘度的胶体溶液, 具有较高的粘性, 可以将其作为制粒粘结剂, 但对于其对生物浸出过程中细菌的氧化活性和金属的浸出率是否存在影响尚不清楚。作为前期的研究工作, 本文将考察粘结剂羧甲基纤维钠对某低品位矿石生物浸出过程中细菌的氧化活性以及浸出率的影响, 为后续将其作为矿石制粒-生物堆浸工艺粘结剂的研究打下基础和提供科学依据。

1实验

1.1材料

实验所用的铜矿来源于新疆某地, 矿石通过破碎、磨细至-74μm后用于后续的试验。化学分析可知该矿石含Cu 0.77%, Fe 5.10%, S0.22%, Cu为主要有价组分, 其他金属没有回收利用的价值。进行了铜的物相分析, 结果表明该矿石氧化铜矿和硫化铜矿所占的比例分别为65.97%, 31.43%。

实验所用的菌种取自北京有色金属研究总院生物冶金国家工程实验室某铜矿常温 (30±5) ℃生物柱浸后的浸出液。菌种培养采用9 K培养基, 其基本组成如下 (g·L^-1) : (NH₄) ₂SO₄, 3.0;K₂HPO₄, 0.5;KCl, 0.1;MgSO₄·7H₂O, 0.5;Ca (NO₃) ₂·2H₂O, 0.01;FeSO₄·7H₂O, 44.22;蒸馏水1000 ml。

实验所用羧甲基纤维素钠 (CMC-Na) 为白色粉末状, 其结构式如图1所示, 可以看出, CMC-Na分子结构中含有大量的极性基团-OH和-COONa。

1.2方法

1.2.1 CMC-Na对细菌氧化活性的影响

试验在250 ml锥形瓶中进行, 考察CMC-Na浓度、初始pH值、接种量、温度、Fe²⁺浓度对细菌氧化活性的影响, 衡量指标为细菌对9 K培养基中Fe²⁺的氧化率, Fe²⁺的氧化率= (C_Fe2_初+-C_Fe2_终+) /C_Fe2_初+×100%, C_Fe2_初+, C_Fe2_终+为Fe²⁺初始和最终浓度。

图1 CMC-Na的结构式Fig.1 Structural formula of CMC-Na

1.2.2 CMC-Na对细菌浸出铜浸出率的影响

试验在250 ml锥形瓶中进行, 摇床温度30℃、转速150 r·min^-1, 浸出10 d。采用正交试验L₉ (3⁴) , 主要考察CMC-Na浓度、初始pH值、接种量、矿浆浓度对细菌浸出时铜浸出率的影响。

1.3检测分析方法

1.3.1 pH值、氧化还原电位 (ORP, oxidation reduction potential) 的测定培养基的p H值采用Thermo Orion 3-Star型pH计进行测量, 采用1∶1硫酸溶液调节培养基的初始pH值;氧化还原电位采用SUNTEX PC-350型电位计进行测定。

1.3.2培养液中Fe²⁺浓度的测定Fe²⁺浓度采用重铬酸钾滴定法测定, 方法为取1 ml的被测液, 加入10 ml的硫磷混酸 (体积比为硫酸∶磷酸∶去离子水=15∶15∶30) , 加入3~4滴质量分数为0.5%的二苯胺磺酸钠作为指示剂, 使用滴定度T=1.0的重铬酸钾溶液进行滴定, 溶液颜色由无色变为紫色, 且30 s内不褪色, 计数重铬酸钾溶液的消耗量并计算溶液中的Fe²⁺的浓度。

1.3.3细菌种群结构的分析细菌培养一段时间后, 取上清液200 ml用冷冻式高速离心机在转速11000 r·min^-1下离心10 min, 然后用去离子水洗涤, 在转速11000 r·min^-1下离心5 min, 洗涤2~3次后, 倒掉离心液, 将收集的菌泥用Powersoil^DNA Isolation kit试剂盒提取DNA, 然后采用实时荧光定量PCR技术分析细菌的种群结构。

2结果与讨论

2.1细菌的活化、转接与扩大培养

实验所用的菌种取自某铜矿常温 (30±5) ℃生物柱浸后的浸出液, 对浸出液中的细菌进行活化、转接培养3次、扩大培养后用于后续的试验。细菌在活化、转接、扩大培养过程中每天测定浸出液的pH值和ORP、Fe²⁺的氧化率, 结果如图2~4所示。

从图2可以看出, 细菌在活化过程中生长良好, ORP随着培养时间的延长一直升高。从图3 (a) 中可以看出, 细菌3次转接培养时pH值随时间的增加均呈现先增加后下降的趋势, 培养初期pH值增加是由于细菌利用培养基中的Fe²⁺为能源物质生长, 将Fe²⁺氧化为Fe³⁺, 该过程中消耗了H⁺, 培养一段时间后p H值下降是由于形成的Fe³⁺水解或是生成了黄钾铁矾沉淀, 释放出H⁺。从图3 (b) 可以看出, 细菌3次转接培养时ORP随着时间的增加而一直增加, ORP随着转接次数的增加上升越快。从图3 (c) 中可以看出, 细菌3次转接培养时Fe²⁺的氧化率随着时间的增加而增加, 直到Fe²⁺被完全氧化。随着转接次数的增加, 细菌完全氧化Fe²⁺所需的时间越短, 第1次转接培养时, 细菌完全氧化Fe²⁺需要100 h, 第2次转接培养时, 细菌完全氧化Fe²⁺需要72 h, 第3次转接培养时, 细菌完全氧化Fe²⁺需要56 h。3次转接培养, 细菌Fe²⁺氧化活性分别为0.077, 0.100, 0.1317g·L^-1·h^-1, 相比于第1次转接培养时, 细菌Fe²⁺氧化活性分别提高了29.87%, 71.04%。从图4可以看出, 细菌在扩大培养的ORP随着培养时间的延长一直升高, 最终保持较高的ORP (约650 m V) 。

2.2 CMC-Na对细菌氧化活性的影响试验

图2 细菌活化时p H值和ORP随时间的变化曲线Fig.2 Curves of p H value and ORP changing with time during bacterial activation

图3 细菌转接培养过程中p H值和ORP Fe2+氧化率随时间的变化曲线 (1~3表示转接次数) Fig.3 Curves of p H value (a) and ORP (b) Fe2+oxided rate changing with time during bacterial transfer culture (1~3 representing transit times)

2.2.1 CMC-Na浓度的影响试验

试验条件为接种量15%, 温度30℃, 转速150 r·min^-1, pH值1.8, 分别加入0, 2, 4, 6, 8, 10 g·L^-1CMC-Na。CMC-Na浓度对细菌氧化活性的影响如图5所示。

从图5可以看出, 细菌对Fe²⁺的氧化率随时间的增加而增加、随CMC-Na浓度的增加而下降。培养93.5 h时CMC-Na浓度为0, 2, 4, 6, 8, 10g·L^-1时, Fe²⁺的氧化率分别为59.21%, 38.37%, 33.72%, 10.47%, 10.47%, 12.79%。与不加CMC-Na时细菌对Fe²⁺的氧化活性相比, 当CMC-Na浓度高于4 g·L^-1时, 细菌对Fe²⁺的氧化活性受到了明显的抑制, 而CMC-Na浓度低于4 g·L^-1时, 细菌对Fe²⁺的氧化活性的抑制作用较小, 因此确定后续的试验CMC-Na的浓度为4 g·L^-1。

图4 扩大培养时p H值和ORP随时间的变化曲线Fig.4 Curves of p H value and ORP changing with time during bacterial expanding culture

图5 CMC-Na浓度对细菌氧化活性的影响Fig.5Effect of CMC-Na concentration on oxidation activity of bacteria

2.2.2初始p H值的影响试验

试验条件为接种量15%, 温度30℃, 摇床转速150 r·min^-1, CMC-Na浓度4 g·L^-1, 初始pH值分别为1.2, 1.5, 1.8, 2.1, 2.4。初始pH值对细菌氧化活性的影响如图6所示。从图6可以看出, 细菌对Fe²⁺的氧化率随时间的增加加、随着培养基初始pH值的增加而增加, pH值为1.2和1.5时, 细菌对Fe²⁺的氧化率较低, pH值为1.8~2.4时, 细菌对Fe²⁺的氧化活性较高, 这一结果与细菌的生长条件密切相关, 试验所用的细菌以中温菌Acidithiobacillus sp.为主, 其最适生长pH范围为1.8~2.5。考虑到pH值高于2时, 细菌氧化Fe²⁺生成的Fe³⁺会发生水解或是形成黄钾铁矾沉淀影响细菌的生长, 因此后续的试验选择培养基的初始pH值为1.8。

图6 初始p H值对细菌氧化活性的影响Fig.6 Effect of initial p H value on oxidation activity of bacteria

2.2.3细菌接种量的影响试验

试验条件为初始pH值1.8, 温度30℃, 摇床转速150 r·min^-1, CMC-Na浓度4 g·L^-1, 细菌接种量分别为5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%。细菌接种量对细菌氧化活性的影响如图7所示。从图7可以看出, 细菌对Fe²⁺的氧化率随时间的增加而增加、随着接种量的增加而增加。接种量为5%时Fe²⁺的氧化率低于其他接种量时Fe²⁺的氧化率。培养96 h时接种量为5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%时, Fe²⁺的氧化率分别为46.51%, 80.90%, 83.90%, 89.53%, 97.70%, 98.88%, 接种量为25%和30%时, 两者Fe²⁺的氧化率仅差1.18%。由于CMC-Na浓度超过一定值后对细菌生长的抑制作用较强, 因此增加接种量有利于提高细菌对CMC-Na的耐受能力, 确定后续试验细菌的接种量为25%较为合适。

2.2.4温度的影响试验

试验条件为接种量25%, 初始p H值1.8, 摇床转速150 r·min^-1, CMC-Na浓度4 g·L^-1, 温度分别为15, 30, 45℃。温度对细菌氧化活性的影响如图8所示。

从图8可以看出, 细菌对Fe²⁺的氧化率随时间的增加而增加。温度对细菌氧化Fe²⁺活性的影响较大, 较高温度45℃时, 细菌对Fe²⁺的氧化率较低;温度为15和30℃时细菌对Fe²⁺的氧化率较高。培养68 h时, 温度为15, 30, 45℃时, Fe²⁺的氧化率分别为97.67%, 98.82%, 13.95%, 温度为30℃时, 细菌对Fe²⁺的氧化率最高, 这一结果与细菌的生长条件密切相关, 试验所用的细菌以中温菌Acidithiobacillus sp.为主, 其最适生长温度范围为30~35℃。因此确定后续试验温度为30℃。

图7 细菌接种量对细菌氧化活性的影响Fig.7 Effect of bacterial inoculation amount onoxidation activ-ity of bacteria

图8 温度对细菌氧化活性的影响Fig.8 Effect of temperature on oxidation activity of bacteria

2.2.5 Fe2+浓度的影响试验

试验条件为接种量25%, 初始p H值1.8, 温度30℃, 摇床转速150 r·min^-1, CMC-Na浓度4 g·L^-1, 培养基中Fe²⁺浓度分别3.0, 4.5, 6.0, 7.5, 9.0 g·L^-1, Fe²⁺浓度对细菌氧化活性的影响如图9所示。

从图9可以看出, 细菌对Fe²⁺的氧化率随时间的增加而增加、随着Fe²⁺浓度的增加而增加。Fe²⁺浓度对细菌氧化Fe²⁺活性的影响较小, 培养68 h时Fe²⁺浓度为3.0, 4.5, 6.0, 7.5, 9.0 g·L^-1时, Fe²⁺的氧化率分别为100%, 97.67%, 98.30%, 98.59%, 98.81%, Fe²⁺的氧化率相差不大, 说明培养基中较低的Fe²⁺浓度也可以满足细菌的生长。

2.3细菌对高浓度CMC-Na耐受性的驯化试验及种群结构的分析

图9 Fe2+浓度对细菌氧化活性的影响Fig.9 Effect of Fe2+concentration on oxidation activity of bac-teria

2.3.1驯化试验

前述的试验结果表明, 当CMC-Na浓度超过4 g·L^-1时, 细菌对Fe²⁺的氧化活性受到了明显的抑制。为了提高细菌对高浓度CMC-Na的耐受性, 需要不断对细菌进行驯化培养。细菌驯化培养的方法为初始CMC-Na浓度为4g·L^-1, 转接培养3次后, 逐步提高CMC-Na的浓度并进行转接培养, 直到CMC-Na的浓度达到10g·L^-1, 停止驯化。其他试验条件为装液量100 ml, 接种量25%, 初始p H值1.8, 温度30℃, 摇床转速150 r·min^-1, 驯化培养过程中测得细菌对Fe²⁺的氧化率随时间的变化如图10 (a) ~ (d) 所示。

从图10 (a) 中可以看出, 初始含4 g·L^-1CMC-Na细菌3次转接培养时Fe²⁺的氧化率随着时间的增加而增加, 直到Fe²⁺被完全氧化。随着转接次数的增加, 细菌完全氧化Fe²⁺所需的时间越短, 第1次转接培养时, 细菌完全氧化Fe²⁺需要72h, 第2次转接培养时, 细菌完全氧化Fe²⁺需要67 h, 第3次转接培养时, 细菌完全氧化Fe²⁺需要45 h。3次转接培养, 细菌Fe²⁺氧化活性分别为0.1167, 0.1284, 0.1933 g·L^-1·h^-1, 相比于第1次转接培养时, 细菌Fe²⁺氧化活性分别提高了10.03%, 65.64%。提高CMC-Na的浓度进行驯化, 从图10 (b) 可以看出, 当CMC-Na的含量高于6 g·L^-1时, 细菌对Fe²⁺的氧化活性受到了明显的抑制, 而CMC-Na浓度低于6 g·L^-1时, 细菌对Fe²⁺的氧化活性的抑制作用较小, 培养51 h时, CMC-Na浓度为4, 6, 8, 10 g·L^-1, Fe²⁺的氧化率分别为85.06%, 68.24%, 11.49%, 11.24%。继续提高CMC-Na的浓度进行驯化, 从图10 (c) 可以看出, 当CMC-Na的浓度高于8 g·L^-1时, 细菌对Fe²⁺的氧化活性受到明显的抑制, CMC-Na的浓度低于8g·L^-1时, 细菌对Fe²⁺的氧化活性的抑制作用较小, 培养71 h时, CMC-Na浓度为6, 8, 10, Fe²⁺的氧化率分别为57.95%, 47.67%, 13.95%。继续提高CMC-Na的浓度进行驯化, 从图10 (d) 可以看出, CMC-Na浓度达到10 g·L^-1时, 细菌对Fe²⁺的氧化率略低于CMC-Na浓度为8 g·L^-1时细菌对Fe²⁺的氧化率, 培养46 h时, CMC-Na浓度为8, 10 g·L^-1, Fe²⁺的氧化率分别为98.85%, 97.73%, 两者相差仅1.12%。结果表明通过驯化培养大大提高了细菌对高浓度CMC-Na的耐受性, 使细菌耐受CMC-Na的浓度从4 g·L^-1提高至10 g·L^-1。

图1 0 细菌驯化过程中Fe2+氧化率随时间变化曲线Fig.10 Curves of Fe2+oxided rate changing with time during bacterial domestication

(a) Bacterial transfer culture three times with CMC-Na concentration being 4 g·L^-1 (1～3 representing transit time) ; (b) Bacterial domestication with CMC-Na concentration being 4, 6, 8, 10 g·L^-1, respectively; (c) Bacterial domestication with CMC-Na concentration being 6, 8, 10 g·L^-1, respectively; (d) Bacterial domestication with CMC-Na concentration being 8, 10 g·L^-1, respectively

2.3.2细菌的种群结构分析

本试验采用实时荧光定量PCR技术对原始菌液及添加4, 6, 8, 10 g·L^-1CMC-Na驯化培养得到的菌液进行细菌种群结构的分析, 细菌培养至对数期, 菌液离心后收集的菌泥用试剂盒Powersoil^DNA Isolation kit提取细菌的DNA, 用此试剂盒提取的DNA纯度较高, 可直接进行PCR扩增。实时荧光定量PCR技术采用Acidithiobacillus sp., Leptopirillum sp., Sulfobacillus sp., Ferroplasma sp.4种设计引物扩增样品的目的基因, 相关基因的标准曲线如图11 (a~d) 所示, 4种设计引物扩增的目的基因实时荧光定量PCR结果如图12 (a~d) 所示。通过Rotor-Gene6000 Series Software 1.7软件和4种设计引物的标准曲线可以计算出样品DNA中各目的基因的拷贝数, 然后计算出对应的细菌的数量, 结果如图13 (a~c) 所示。

实时荧光定量PCR结果表明, 只有3种特异性引物扩增成功, Acidithiobacillus sp., Leptopirillum sp., Ferroplasma sp.3种细菌, 其中Acidithiobacillus sp.为主要的菌种, 所占的比例高达99.81%, Leptopirillum sp.和Ferroplasma sp.两者所占的比例之和不到0.2%;发现含4, 6, 8, 10 g·L^-1CMC-Na培养的菌液中Acidithiobacillus sp.均为主要的菌种, 所占的比例分别为99.82%, 99.72%, 99.99%, 81.07%;菌液中均检测到Leptopirillum sp.细菌, 所占的比例分别为0.08%, 0.01%, 0.01%, 17.26%;此外在含6和10 g·L^-1CMC-Na培养的菌液中含有少量的古菌Ferroplasma sp., 所占的比例分别为0.27%, 1.67%;菌液中均未检测到Sulfobacillus sp., 这一结果与各细菌所生长的环境以及实验时细菌的培养条件是密切相关的。Acidithiobacillus sp.属于革兰氏阴性无机化能自养菌, 能够氧化Fe²⁺、金属硫化物、单质硫等, 能够在pH值0.5~6.0、温度15~35℃范围内生长 ^[17] ;Leptopirillum sp.属于革兰氏阴性, 专性化能无机营养型细菌, 通过Benson-Calvin循环固定碳, Fe²⁺作为唯一的电子供体 ^[18] ;Sulfobacillus sp.可以利用Fe²⁺、单质硫及硫化物生长, 其适宜生长温度范围为45~50℃ ^[17] 。Ferroplasma sp.可以在p H值为1.3~2.2、温度为15~45℃范围内生长, 可以氧化Fe²⁺ ^[19] 。试验过程中细菌的培养均在30℃温度下9 K培养基中进行的, 该条件满足细菌Acidithiobacillus sp., Leptopirillum sp., Ferroplasma sp.生长所需的环境条件, 而Acidithibacillus sp.的最适生长温度为30℃, 同时原始菌液中该菌为主要菌种, 随着驯化时间和次数的增加, 该菌在整个驯化过程中一直起着主导作用。

图1 1 实时荧光定量PCR试验4种设计引物的标准曲线图Fig.11 Sstandard curves of four desin primers in FQ-PCR test (CT standing for cycle threshold)

(a) Acidithiobacillus sp.; (b) Leptopirillum sp.; (c) Sulfobacillus sp.; (d) Ferroplasma sp.

图1 2 实时荧光定量PCR结果Fig.12 Results of FQ-PCR

(a) 0, 4 g·L^-1CMC-Na; (b) 6 g·L^-1CMC-Na; (c) 8 g·L^-1CMC-Na; (d) 10 g·L^-1CMC-Na

图1 3 培养基中各细菌:Acidithiobacillus sp., Leptopirillum sp., Ferroplasma sp.所占的比例Fig.13 Percent of bacteria in medium

(a) Acidithiobacillus sp.; (b) Leptopirillum sp.; (c) Ferroplasma sp.

2.4 CMC-Na对细菌浸出时铜浸出率的影响

前面的试验结果表明, 9K培养基中CMC-Na浓度超过4 g·L^-1后会影响细菌对Fe²⁺的氧化活性, 细菌可以将Fe²⁺氧化为Fe³⁺, Fe³⁺作为硫化矿的氧化剂, 进而细菌的浸矿性能也会受到影响。试验采用正交试验考察CMC-Na浓度 (A) 、接种量 (B) 、矿浆浓度 (C) 、初始p H值 (D) 4个因素对细菌浸矿性能的影响, 每个因素设置3个水平, 因此选取L₉ (3⁴) 作为正交试验设计, 实验因素及水平编码如表1所示。试验在250 ml的锥形瓶中进行, 放置在30℃、转速为150 r·min^-1摇床中培养, 浸出周期为10 d, 浸出结束后测定浸出液中Cu²⁺的浓度并计算液计Cu的浸出率, 正交试验设计及试验结果如表2所示, 测得各试验条件下浸出液的pH值、ORP随时间的变化如图14 (a) ~ (b) 所示。表2中, K₁, K₂, K₃分别表示各相应因素下各水平对应的试验指标值之和, k₁, k₂, k₃分别表示各相应因素下各水平对应的试验指标的均值, r表示因素的极差, 反映了各因素作用的大小, 该值越大, 意味着对应因素的不同水平给试验指标所造成的差别较大, 根据极差值的大小可以确定各因素的主次顺序, 可以看出各因素对铜的浸出率的影响大小顺序为:CMC-Na浓度>接种量>初始p H值>矿浆浓度, 其中CMC-Na浓度对铜浸出率的影响最大, 一方面前面的试验结果表明CMC-Na浓度超过4 g·L^-1时, 细菌对Fe²⁺的氧化活性受到了明显的抑制, 而细菌利用Fe²⁺作为能源物质, 将其氧化为Fe³⁺释放出能量来满足自身的生长与繁殖, Fe³⁺作为金属硫化矿的氧化剂, Fe³⁺得不到充分的补充, 金属离子的浸出率必然会受到影响, 相关的化学方程式如下:

表1 正交试验因素及水平编码Table 1Encoding of orthogonal experimental factors and levels 下载原图

表1 正交试验因素及水平编码Table 1Encoding of orthogonal experimental factors and levels

表2 正交实验设计及实验结果Table 2 Orthogonal experimental design and results 下载原图

表2 正交实验设计及实验结果Table 2 Orthogonal experimental design and results

另一方面, CMC-Na结构中含有大量的极性基团-OH和-COONa, 根据软硬酸碱原则, “硬酸与硬碱相结合, 软酸与软碱相结合, 常常形成稳定的配合物”, 而Fe³⁺属于硬酸, Fe²⁺属于交界酸, -OH, -COO^-属于硬碱, Fe³⁺或Fe²⁺能与-OH, -COO^-形成配合物, 导致溶液中Fe³⁺或Fe²⁺浓度的降低, 进而影响铜矿的浸出效果。

3结论

1.粘结剂CMC-Na对细菌氧化Fe²⁺活性有很大的影响。与不加CMC-Na时细菌对Fe²⁺的氧化活性相比, 当CMC-Na浓度高于4 g·L^-1时, 细菌对Fe²⁺的氧化活性受到了明显的抑制, 而CMC-Na浓度低于4 g·L^-1时, 细菌对Fe²⁺的氧化活性的抑制作用较小。

图1 4 各试验条件下p H值和ORP随时间的变化曲线Fig.14 Curves of p H value and ORP changing with time at different experimental condition

2.通过逐步驯化培养, 大大提高了细菌对高浓度CMC-Na的耐受性, 细菌耐受CMC-Na的浓度从4 g·L^-1提升至10 g·L^-1。

3.通过实时荧光定量PCR技术查明原始菌液、添加4, 6, 8, 10 g·L^-1CMC-Na培养的菌液中均存在Acidithiobacillus sp., Leptopirillum sp., Ferroplasma sp.3种细菌, 其中Acidithiobacillus sp.均为优势菌种。

4.通过正交试验L₉ (3⁴) 得出各因素对铜浸出率的影响大小顺序为:CMC-Na浓度>接种量>初始pH值>矿浆浓度, 其中CNC-Na浓度对铜浸出率的影响最大。