简介概要

高温浸矿微生物的选育探索

来源期刊：稀有金属2002年第3期

论文作者：孙雪南车小奎徐晓春阮仁满

关键词：生物浸出; 高温菌; 筛选模型;

摘要：以从(50～60 ℃)酸性温泉中采集的菌为选育对象,研究确定浸矿高温菌初筛、复筛的方法后,用该方法获得高温浸矿菌 retech-Y .通过生理生化的研究鉴定 retech-Y 为兼性异养菌,此高温菌的最适生长条件为:FeTSB0 培养基,pH 1.60,Fe2+ 含量 90 mmol/L,最适温度为 60 ℃, 最适生长周期为24 h, Fe2+ 氧化率为 100%,菌数为7×107个/ml.

稀有金属 2002,(03),210-213 DOI:10.13373/j.cnki.cjrm.2002.03.013

高温浸矿微生物的选育探索

孙雪南阮仁满车小奎

北京有色金属研究总院,北京有色金属研究总院,北京有色金属研究总院,北京有色金属研究总院北京100088 ,北京100088 ,北京100088 ,北京100088

摘要：

以从 (5 0～ 6 0℃ ) 酸性温泉中采集的菌为选育对象 , 研究确定浸矿高温菌初筛、复筛的方法后 , 用该方法获得高温浸矿菌retech Y。通过生理生化的研究鉴定retech Y为兼性异养菌 , 此高温菌的最适生长条件为 :FeTSB0 培养基 , pH 1.6 0 , Fe2 + 含量 90mmol/L , 最适温度为 6 0℃ , 最适生长周期为 2 4h , Fe2 + 氧化率为 10 0 % , 菌数为 7× 10 7个 /ml。

关键词：

生物浸出;高温菌;筛选模型;

中图分类号： TF18

收稿日期：2002-01-25

Strategy for Isolating Moderately Thermophilic and Acidophilic Bioleaching Bacterium

Abstract：

An screening assay was developed in order to directly and simply isolate moderately thermophilic and acidopHilic iron oxidizing Thiobacillu from acidophilic geothermal areas. This method was used to obtain a thermophilic chemolithoheterotrophs strain named as retech Y from acidopHilic hot spring. The isolated species were grown in ferrous iron yeast extract medium containing 90 mmol/L ferric iron, 0.035% yeast extract, and basal salt, in which iron acts as the energy source and yeast extract is the carbon source.The results show that the optimal temperature is 60℃ and pH value is 1.60 for its growth condition. When incubated for up to 24 h, the number of 7×10 7 cell/ml is obtained and 100% ferric iron is oxidized.

Keyword：

Bioleaching; Moderately thermophilic and acidophilic bacteria; Screening technology;

Received： 2002-01-25

近几年来, 人们从自然界中分离到一些中温嗜热细菌和嗜热古细菌, 这些菌能在40~80 ℃温度范围内生长, 具有更强的氧化硫、金属硫化物、Fe²⁺ 的能力, 具耐酸、耐高温等特点, 使其更适于生物浸出 ^[1,2,3,4] , 用高温菌浸出时, 可解决大量黄铜矿用常温嗜酸菌难以浸出等问题, 仅用4~5 d时间, 铜浸出率就可高达 90% 以上;而且可解决实际堆浸时由于矿堆内部温度高达 40~80℃造成氧化亚铁硫杆菌等中温菌无法生长, 浸出周期长, 效率低, 对堆浸的工艺要求高等问题, 产生显著的经济效益;此外, 可解决由于机械搅拌及矿物化学反应产生大量的热需冷却系统的问题。因此, 用高温菌进行细菌浸出是目前世界上生物冶金技术推广应用的新途径, 选育氧化能力强、浸矿周期短、浸出率高的耐高温菌, 具有重要的经济意义。但由于浸矿菌株为极端资源微生物, 其选育和培养、保藏技术与常用微生物技术有很大的区别, 因此研究新的选育方法至关重要。

1 研究材料与方法

1.1 菌种采集及培养基

从高温酸性硫磺温泉 (50~60 ℃) 中, 用膜过滤法浓缩采集。

FeTSB₀ 培养基:FeSO₄·7H₂O 溶液:20%, pH 2.0~2.5;胰蛋白胨肉汤 (g/L) : (NH₄) ₂SO₄ 1.8, MgSO₄·7H₂O 0.7, 胰蛋白胨 0.35, pH 2.0~3.0; 胶溶液:0.7% 配制混合比例 1∶14∶5 (体积比)

3K培养基: (NH₄) ₂SO₄ 3 g, KCl 0.1 g, K₂HPO₄ 0.5 g, MgSO₄·7H₂O 0.5 g, Ca (NO₃) ₂ 0.01 g, 蒸馏水 700 ml, 144 mmol/L FeSO₄·7H₂O 溶液 300 ml; pH 1.6~2.2。

硫磺粉培养基: (NH₄) ₂SO₄ 0.2 g, KCl 0.01 g, K₂HPO₄ 0.025 g, MgSO₄·7H₂O 0.025 g, Ca (NO₃) ₂ 0.001 g, 硫磺粉 5 g, 蒸馏水 1000 ml, pH 3.5。

1.2 筛选方法

初筛方法:将从 (50~60℃) 酸性温泉中取的水样, 在不同培养基、不同的稀释度下用96孔细胞培养板培养, 每种培养基做5个平行样, 并以未接水样的培养基为对照。培养时间为5, 7, 10, 14, 20 d。其中 FeSO₄ 浓度为 3.6 mmol/L。加入 1% 硫氰酸钠 50 μl 作为铁氧化细菌氧化铁能力的指示剂。用 50 μl 0.05% 的甲基橙 (pH 指示范围为 4.0~2.0) 及0.1%白酚里 (pH 指示范围为 2.8~1.2) 作为氧化硫能力的指示剂。

复筛方法:经过初筛后把细胞培养板培养筛选获得的菌接入试管后放大移入 200 ml 三角瓶装量为 100 ml 的具黄铁矿不同含量的液体无 Fe²⁺ 的 3K 培养基和 FeTSB₀ 培养基, 于 60 ℃ 水浴恒温振荡器培养。黄铁矿含量依次增加为 1 g, 2 g, 3 g, 4 g, 5 g。每次的接种量从50%依次减为30%, 20%, 10%。培养4~5 d后转接一次, 连续转接培养6代。直到菌浓度为 1×10⁷ 以上。

从初步培养的菌浓度为 1×10⁷ 以上的菌液中吸取 20 ml 移入 200 ml 三角瓶装量为 50 ml 的 FeTSB₀ 培养基, 于 60 ℃水浴摇床培养。Fe²⁺ 含量为 70 mmol/L, pH 1.4~2.2, 培养 2~3 d 后转接入相应培养基中继续培养, 在此期间每天测 pH, Eh, 铁氧化能力, 多次转接培育至细菌数达 5×10⁷ 个/ml 以上。

测定方法:铁氧化能力测定方法:用 10 mmol/L KMnO₄ 滴定法及氧化还原电位测定;还原硫的氧化能力:检测pH值的变化;细菌数测定法:显微镜直接计数法。

2 结果与讨论

2.1 理化性质

从富集培养菌的菌液中用不断连续稀释法纯化菌株后, 编号为 retech-Y, 取 1 ml 接种于相应 FeTSB₀ 固体培养基中, 用双层培养法培养, 观察生长情况。结果见表1。

表1 培养菌的生长的一般理化行为

Table 1 Growth character of strain retech-Y

培养时间	菌落特征	细胞特征
3~5 d	直径 0.5~1mmol/L、圆形、圆锥形、奶油色	3~5μm、棒状、G⁺
2~3星期	直径0.5~1mmol/L、大面积圆形、褐色	同上

该菌不能在3K固体培养基上生长, 在3K 液体培养基中能生长, 只是生长不良, 但如果在3K 液体培养基中添加0.025%的胰蛋白胨时则在24 h内迅速生长, 菌浓度可达5×10⁷个/ml。说明该菌为兼性异养菌, 在有机物存在下更适于生长繁殖。

2.2 生理生长条件优化

从富集培养的10瓶菌中挑选出一瓶长势最好的菌, 并做扩大培养, 培养基量从 50 ml 扩大到100 ml, 接种量为 10%, 在 FeTSB₀ 液体培养基连续培养5代后做pH, Fe²⁺ 含量, 温度, 接种量4个条件的优化研究, 以确定最佳生理生长培养条件。

适宜生长pH:细菌浸矿时, 环境酸度对细菌生长有明显影响, 它影响细菌的活性及繁殖速度, 从而影响矿物浸出。此外, 由于矿石实际浸出介质中黄铁矿氧化后会产生大量的Fe³⁺, 浸出时应控制酸度在 pH 1.8 以下, 以防止Fe³⁺沉淀。故在浸矿微生物的选育过程中, 优良浸矿菌株不仅具有强的铁、硫氧化能力, 而且能在低pH (1.8 以下) 条件下具有强的氧化能力, 从而加强直接细菌氧化作用和强氧化剂有效Fe³⁺的间接氧化作用。所以在本文的研究中经过初筛后一直以pH (1.8 以下) 为其中的一个重要选择压力进行连续传代培养法进行选育。文献表明 ^[5,6] , 当pH为1.4 以下, 会严重影响细胞膜渗透压, 破坏细胞内外质子平衡。因此, 本研究中的适宜生长pH研究范围为1.4~1.8之间。结果见图1和2。

图1 不同初始pH值的生长变化

Fig.1 Effect of initial pH on strain growth

图2 不同初始pH值对细菌铁氧化率和生长的影响

Fig.2 Effect of different initial pH on the strain growth and Ferrous iron oxidization rate

从图1和2中可以看出, 最初pH为1.6时, 培养12 h后pH值升高最明显, 而且培养24 h后最初pH为1.6时浸矿高温菌的铁氧化率为100%, 菌数为7×10⁷个/ml, 当最初pH 1.5, pH 1.7 时菌液的铁氧化能力次之, 最初pH为1.4和1.75时铁最高氧化率分别为81.5%, 89.5%。但是在氧化过程中pH为1.75时, 铁氧化速率快于低pH。延长培养时间为48 h, pH为1.4时铁氧化速率可达100%。这说明低pH值时抑制该菌的快速繁殖, 停滞期过长, 不适合该菌的生长。同时从图2中也表明培养48 h后pH为1.4的该菌数最少为2.8×10⁷个/ml, 而pH为1.75时菌数也达7.4×10⁷个/ml, 所以低pH值影响该菌的生长。从图1和2可知道最初pH为1.6时该菌不仅铁氧化率高而且生长速度最快。因此该浸矿高温菌的最适pH为1.60。

适宜能源Fe²⁺含量:在细菌生长环境的各种金属离子中, 低价Fe²⁺是细菌的能源, 细菌将Fe²⁺氧化成Fe³⁺而获得能量, 同时Fe³⁺是金属硫化矿物的高效氧化剂。Fe³⁺氧化金属矿物后还原为Fe²⁺, 细菌又将Fe²⁺氧化成Fe³⁺, 此氧化还原过程反复进行, 所以在浸出介质中同时存在Fe²⁺和Fe³⁺。但是每种微生物对Fe²⁺的需求是不同的, 如在常温酸性浸矿环境中广泛分布的氧化亚铁硫杆菌的铁耐受性就很强, Fe²⁺的浓度可达160 mmol/L, 但是耐热温度为45~55℃的嗜热硫氧化菌在Fe²⁺的浓度可达 160 mmol/L 时抑制该菌的生长, 其最适铁浓度为 100 mmol/L。此外, 通常过量的Fe²⁺的存在产生过量的Fe³⁺对浸出反应也不利 (产生沉淀, 附着于矿石表面或堵塞矿堆中的孔隙) 。因此, 合适的Fe²⁺含量的确定对浸矿微生物就很重要。本研究在国外已经选育出的浸矿高温菌的一些铁氧化性质的基础上 ^[7,8] , 选择合适的Fe²⁺含量的范围进行研究, 选择Fe²⁺含量分别为 100, 90, 70, 50 mmol/L, 结果见图3和4。

图3 初始Fe3+浓度对细菌生长pH的影响

Fig.3 Effect of initial Ferric concentration on strain retech Y growth pH

图4 不同初始Fe3+含量对细菌浸出电位的影响

Fig.4 Effect of different initial Ferric concentration on bioleach oxidation-reduction poptenial

从图3和4可以看出, 不同Fe²⁺浓度影响着细菌生长时菌液pH, 电位的变化。Fe²⁺浓度为 90 mmol/L 培养的菌pH变化最快, 培养12 h后菌液颜色变为深红, 电位也快速上升, 上升幅度最大为 120 mV, 表明细菌已经开始将Fe²⁺氧化成Fe³⁺。此后, 随着细菌氧化活性的增强, pH开始下降, 氧化还原电位水平继续上升, 在培养24 h后, 浓度为90 mmol/L 的 Fe²⁺被全部氧化, 电位达459 mV为最大。Fe²⁺ 浓度为 100 mmol/L 时, 抑制菌的铁氧化能力, 最高电位为 421 mV。同样 Fe²⁺ 浓度 70 mmol/L 和 50 mmol/L 都对菌生长活性及铁氧化活性有抑制作用。确定此高温菌最适 Fe²⁺ 浓度为 90 mmol/l。

温度的优化:每种细菌都有各自最适应的生长温度条件, 一般浸出采用的中温菌适宜生长温度为 25~35 ℃, 当温度高于45 ℃时, 细菌生长受影响, 甚至于死亡 ^[9] 。金属硫化矿的氧化是放热反应, 在高硫的硫化金属矿的生物浸出过程中产生大量的热量, 这不利于不耐热的细菌的生长繁殖和细菌氧化硫化物反应的进行, 而浸矿高温菌能解决这一问题。一般最适于细菌生长的温度, 也是细菌氧化活性最佳的温度, 而浸出过程中细菌氧化活性的高低影响相应的金属浸出率, 所以确定浸矿高温菌的最适生长温度很重要。本实验采集的环境温度为50~60 ℃的酸性温泉, 故主要考察了此温度范围对菌生长和氧化活性的影响。见图5和图6。

从图5和6中可以看出该菌在60 ℃培养下, 培养24 h后pH上升最高, 而且菌液氧化还原电位水平在培养期间一直比 55 ℃和50 ℃条件下培养的高, 在温度为60 ℃的培养过程中该菌生长12 h后铁氧化率为55%, 菌数达4×10⁷个/ml, 生长速度最快。而在55℃ 和 50℃条件下培养的菌分别培养在36 h和48 h后菌数达4×10⁷个/ml, 氧化还原电位水平也较低, 生长速度比60 ℃条件下的慢。说明温度低时, 该菌的生长速率和氧化活性减慢。但是该高温菌在60 ℃条件下培养时间延长为48 h后, 菌数和电位都下降, 而且水平与50 、55℃时基本相同。

图5 培养温度对细菌活性的影响

Fig.5 Effect of culture temperature on the strain Retech-Y growth activity

图6 温度对菌铁氧化能力的影响

Fig.6 Effect of temperature on the strain retech-Y Ferrous iron oxidization rate

在以Fe²⁺为能源的培养基中过24 h后稳定期很短, 并且迅速进入生长衰亡期。故该菌的生长周期较短, 繁殖速率快。有利于解决生物浸出周期长的问题及常温菌繁殖速度慢的问题。从上述研究可见, 温度对该菌的生长和氧化活性有显著影响。该菌的适宜生长温度为60℃, 生长周期为24 h。

4 结论

通过对浸矿高温菌选育技术和方法的研究, 确定了分别以硫氰酸钠、甲基橙、白里酚作为初筛的方法及用黄铁矿的氧化率、低 pH、高温条件的多重选择压力连续选育作为筛选高温菌的复筛方法。并用该选育技术, 从温泉 (50~60℃) 采集的混合菌为出发菌选育得到兼性异养菌retech-Y菌株。而且对其生理生长条件进行了优化研究。通过生理生化的研究鉴定 retech-Y为兼性异养菌, 有机营养物促进生长。此高温菌的最适生长条件为:在FeTSB₀ 培养基中pH为1.60, Fe²⁺ 含量为 90 mmol/L, 最适温度为 60 ℃, Fe²⁺ 氧化率为100%, 菌数为7×10⁷。得到的 retech-Y 菌的生长周期较短, 最适生长周期为24 h, 繁殖速率快。