DOI: 10.11817/j.issn.1672-7207.2016.11.006

矿物药朱砂加工流程中可溶性重金属含量的仿生提取-ICP-OES测定方法

蒋秋桃¹，曾丽¹，马杰²，李文莉²，丁野²，李洁¹

(1. 中南大学 化学化工学院，湖南 长沙，410083；

2. 湖南省食品药品检验研究院，湖南 长沙，410001)

摘要：收集朱砂生产加工工艺流程中不同工艺点的样品，采用仿生提取-电感耦合等离子体发射原子光谱法(仿生提取-ICP-OES法)对朱砂样品中可溶性重金属含量进行测定。研究结果表明：仿生提取-ICP-OES法能满足13种重金属同时检测要求，13种重金属线性范围均在0.1~1 000.0 μg /L之间，线性相关系数为0.990 1~1.000 0，检出限为0.089 3~16.041 4 μg /L；该方法重复性相对标准偏差D_RS均小于10.0%，精密度的D_RS均小于7.1%，加样回收率为83.0%~117.5%，满足检测要求；在工艺流程中，朱砂的可溶性重金属含量呈逐步降低趋势，参照《药用植物及制剂进出口绿色行业标准》的限量标准，仅有H-5的Cd超出标准及H-3，H-4和H-5样品的Pb超出标准；仿生提取-ICP-OES法简单、快速，准确性及精度高，能够通过同时检测朱砂加工工艺过程中13种可溶性重金属含量检测，为实时监控朱砂加工工艺质量提供参考依据，有助于完善并确定最佳的朱砂生产加工流程。

关键词：朱砂；仿生提取；ICP-OES法；重金属

中图分类号：TQ462+.24；R282.77；O652.1     文献标志码：A        文章编号：1672-7207(2016)11-3658-06

Determination method of soluble heavy metals in mineral medicine cinnabaris in process of production and processing by ICP-OES with bionic extraction and microwave digestion technology

JIANG Qiutao¹, ZENG Li¹, MA Jie², LI Wenli², DING Ye², LI Jie¹

(1. School of Chemistry and Chemical Engineering, Central South University, Changsha 410083, China;

2. Hunan Food and Drug Inspection Institute, Changsha 410001, China)

Abstract: Cinnabar samples with different processes in production and processing process were collected. Soluble heavy metals in cinnabaris were determined in the process of production and processing by inductively coupled plasma- optical emission spectrometry(ICP-OES) with bionic extraction and microwave digestion technology. The results show that 13 kinds of elements have excellent linearity over the range of 0.1-1 000.0 μg/L with a correlation coefficient of  0.990 1-1.000 0. Limits of detection are in the range of 0.089 3-16.041 4 μg/L. Relative standard deviation D_RS of the repeatability is less than 10.0%. D_RS of precision is lower than 7.1%. Spike recoveries in the range of 83.0%-117.5% are obtained. In the process, the content of soluble heavy metals’ gradually reduces. With reference to green trade standards of importing & exporting medicinal plants & preparations, none of the samples surpass the legal limit for Cd in H-5 and Pb in H-3, H-4 and H-5. The bionic extraction-ICP-OES method is simple and fast, and it has high accuracy and high precision. This method provides reference for real-timely monitoring process quality with simultaneously detecting cinnabaris’ 13 kinds of soluble heavy metals in machining process. The method can help improve and determine the best cinnabaris’ production and processing processes.

Key words: cinnabaris; bionic extraction; ICP-OES method; heavy metals

朱砂作为矿物药，是许多中药制剂的原料药材。近几年来，朱砂的毒理药理受到人们的广泛关注。重金属容易在体内积蓄，通过循环系统运输至身体各个部位，对人体的器官造成严重损害，因此，针对有毒有害的重金属含量超标问题是毒理药理研究的重要部分^[1-5]。矿物药中重金属的作用具有两重性：一方面，重金属作为矿物药的有效成分，是复方药的组成单元^[6]，如朱砂中主成分是硫化汞；另一方面，重金属对人体具有一定的毒性，如矿物药中的As，Hg，Cd，Cr和Pb等均为有毒有害的重金属元素。合理评价矿物药中重金属含量尤为重要。朱砂在被服用后，人体并不能吸收全部重金属，只有在人体内溶出的部分重金属才能部分被吸收^[7]，通过新陈代谢作用，产生相应作用。重金属的溶出率直接影响矿物药的生物利用率，许多研究认为朱砂的药效及毒性与可溶性汞的含量密切相关，因此，只采用重金属的总含量作为评价朱砂毒性的唯一指标显得不科学也不合理。而通过人工胃液模拟的可溶性重金属含量检测作为朱砂毒性的质控标准更能体现现代检验检测技术的优越性，对朱砂的应用评价也显得更科学、合理^[8-10]。朱砂的生产工艺从矿石开采到水飞朱砂成品主要为采集、淘洗、初球磨、再球磨、滤水、干燥、粉碎、包装等，本文作者利用简单、快速、准确性良好且精度高的仿生提取-ICP-OES法主要考察淘洗、球磨、粉碎等主要关键工艺中朱砂的可溶性重金属含量变化情况^[11-14]，以实现对朱砂的生产工艺流程实施监控，科学评价各工艺对朱砂加工的减毒增效作用。

1  实验

本研究所用样品为某企业朱砂加工工艺流程中几个关键工艺中所取样的5批样品，样品信息见表1。

表1  样品信息

Table 1  Information of samples

1.1  仪器和试剂

仪器：AE200电子分析天平(德国梅特勒-托利多公司)；ICPE-9000电感耦合等离子体原子发射光谱仪(日本岛津公司)；KS 4000i恒温培养摇床(德国Ika公司)。

试剂：混合元素标准溶液(Al，As，B，Ba，Be，Bi，Cd，Co，Cr，Cu，Fe，Ga，Li，Mg，Mn，Ni，Pb，Sb，Sn，Sr，Ti，Tl，V和Zn，编号为GSB04-1767-2004，国家有色金属及电子材料分析中心生产，标准值为1 g/L)；汞单元素标准溶液(编号为GBW08617，标准值为1 g/L，中国计量科学研究院提供)；HNO₃(MOS级)；实验用水均为Milli－Q制备的电阻率为18.2 MΩ的超纯水；胃蛋白酶(酶活力1:3 000，上海蓝季科技发展有限公司提供)。

人工胃液：按照《中国药典》2010 版二部附录85要求配制人工胃液。即取稀盐酸16.4 mL，加水800 mL与胃蛋白酶10 g，摇匀后，加水稀释成1000 mL即得。

1.2  仪器工作条件

ICPE-9000分析参数：氩气气压为467.30 MPa，功率为1.2 kW，等离子体流量为10.00 L/min，辅助气流量为0.60 L/min，载气流量为0.70 L/min；观测方向为Axial，位置为Low，泵速为20 r/min；仪器稳定延时15 s，溶剂清洗30 s，样品清洗45 s，吹扫次数为3次。

1.3  混合标准溶液的制备

取混合元素标准溶液和汞单元素标准溶液适量，加pH=1.5的盐酸，依次稀释成各种质量浓度的混合标准溶液，分别为0，10，50，100，200，400，600和1 000 μg/L，摇匀，待测。

1.4  实验步骤

采用仿生提取人工胃液模拟的方法处理样品，利用ICP-OES法检测朱砂中的重金属含量。仿生提取是指配制人工胃液模拟人体消化药物情况，具体参数根据人体消化环境为参数条件。即取朱砂粉0.2 g左右，精密称定，放入容积为50 mL的离心管，加入40 mL的人工胃液，在恒温振荡器中(37 ℃，250 r/min)震荡；4 h后，离心分离(离心机转速为5 000 r/min，时间为5 min)。取上清液，过直径为0.45 μm 水溶性滤膜。取4 mL过滤后的胃液，置于聚四氟乙烯消解罐中，加入3 mL HNO₃消解液，按表2所示程序进行微波消解。消解完毕后，设置赶酸仪的温度为120 ℃，赶酸2~3 h，至溶液体积剩余2~3 mL。用超纯水定容至20 mL，待测，同时制备空白样品。按照ICP-OES仪器优化条件进行3次平行实验检测。

2  结果与讨论

2.1  提取介质考察

在考察提取介质成分对朱砂的溶出情况影响的设计中，主要根据化学势与物质浓度的定量关系进行分析，化学势与物质浓度的定量关系为

μ_i(T)=μ_i^*(T，P)+RTln(a_i/a^*)

其中：μ_i为物质的化学势；μ_i^*为标准化学势；a_i为物质的活度；a^*为标准物质的活度；活度a=γc；c为物质的浓度。根据上述公式可知：作为吸收朱砂可溶性物质的胃液，其pH与成分均可通过影响汞等朱砂各成分在胃液中的化学势影响各成分的溶出度。

根据这一原理，在选用人工胃液为朱砂的提取介质时，考虑介质pH、温度等因素，均设计成与胃液基本一致的条件，从而保证朱砂在实验过程中的环境与体内消化环境一致，使得提取后检测结果具有一定的临床研究意义及价值。

2.2  提取液的处理方法考察

初步预实验，将朱砂粉进行仿生提取4 h后，离心分离，取上清液，经过直径为0.45 μm的水溶性滤膜过滤，直接在ICP-OES仪器上进样检测，等离子火焰出现猝灭现象。

针对出现的猝灭现象，采用微波消解技术对提取液进行消解处理。采用直接微波消解胃液模拟提取液及添加一定量纯度为MOS级的HNO₃提取液这2种消解模式考察消解情况^[15]。微波消解主要利用微波加热封闭容器中的消解液和朱砂样品，在设定的高温增压条件下，使朱砂样品进行快速、彻底消化^[16]。分析消解样品的澄清度可知添加HNO₃的消解效果明显比未添加HNO₃的消解液的消解效果好。通过对比实验现象，选用在胃液模拟后添加一定量的HNO₃进行微波消解。微波消解步骤如表2所示。

表2  微波消解程序

Table 2  Parameter for microwave digestion

对于纯度为MOS级HNO₃的加入量，主要考察2，3和4 mL这3个组别。2 mL纯度为MOS级的HNO₃加入组重金属含量变化波动较大，3 mL和4 mL HNO₃加入组重金属含量基本无变化，考虑环境因素，降低HNO₃用量。故本实验选择添加3 mL HNO₃来处理胃液提取模拟液并进行微波消解处理。

2.3  仿生提取时间考察

随着用药时间延续，可溶性重金属的浓度也随之变化。为探究朱砂经胃液模拟后重金属含量达到最大的时间，通过选取不同提取时间段胃液模拟液进行检测。鉴于含矿物中药制剂服药周期基本为3次/d，用药周期为8 h。本实验考察时间选定为8 h。在考察过程中，每隔2 h选取胃液模拟液进行检测实验。选取编号为F-1朱砂作为研究对象，考察了通过方法学的13个元素，仿生提取时间考察结果见表3。

表3  仿生提取不同时间的各元素溶出质量分数 (n=3次)

Table 3  Concentration of soluble heavy metals from bionic extraction at different times (n=3)     mg/kg

从表3可以看出：在1~4 h内，重金属的质量分数基本呈现上升趋势，4~8 h内大部分重金属质量分数略有下降；可溶性质量分数随着提取时间延长而增大，而由于提取液环境的变化，溶解出的重金属可能由于形成配合物等其他形式而造成可溶性重金属质量分数略有下降，其具体原因还有待进一步研究。仿生提取实验是通过配制人工胃液，模拟朱砂中的重金属在人体内经过胃蛋白酶等作用的溶解过程。根据仿生原理，此过程呈现的朱砂可溶性重金属质量分数变化可模拟朱砂在人体内消化过程中重金属质量分数的变化。由于每个重金属质量分数并不能在同一个时间点达到可溶性重金属质量分数最高值，通过表3所示结果，在仿生提取4 h时朱砂的可溶性重金属元素质量分数基本达到最大值。鉴于提取的4 h时重金属的可溶性质量分数达到高值，基本能够反映重金属溶解的最大质量分数，为统一考察时间，最终选择仿生提取的4 h为实验研究的最佳提取时间。

2.4  方法学考察

2.4.1  线性范围考察

将已配制的混合标准溶液按照实验测试条件操作，实验中对25种(即Al，As，B，Ba，Be，Bi，Cd，Co，Cr，Cu，Fe，Ga，Hg，Li，Mg，Mn，Ni，Pb，Sb，Sn，Sr，Ti，Tl，V和Zn)重金属元素检测进行方法学验证。通过方法学考察的重金属元素只有13种，分别为Be，Cd，Cr，Cu，Fe，Ga，Mn，Ni，Pb，Sn，Sr，V和Zn。其余元素在该方法中的加样回收率未能达到检测要求，故在方法学的其他考察因素中均未列出其余重金属。本次实验通过方法学考察的13种重金属以离子质量浓度为横坐标，谱线强度为纵坐标，进行线性回归处理。各元素的标准曲线关系式及相关系数等见表4。

2.4.2  检出限

利用仿生提取法制备11 个空白试剂，按与样品测定完全相同的实验条件同时测定，计算出11次测定结果的标准偏差，取其结果的3倍标准偏差所及其对应的质量浓度为每种元素的检出限，结果见表4。

2.4.3  精密度试验

取质量浓度为50 μg/L的混合标准溶液连续进行6次实验，所得各金属元素的相对标准偏差D_RS见表4。

2.4.4  重复性试验

取样品约0.2 g，精密称定，平行制备6份样品，按上述条件进行实验测定，计算各金属6次测定的平均质量浓度和D_RS，结果见表4。

2.4.5  加样回收率试验

称取样品约0.1 g，精密称定，加入一定标准量的混合标准溶液按与样品处理测试完全相同的实验条件，进行回收实验，进行平行6次实验，结果见表4。

从表4可以看出：不同元素的检出限之间存在一定的差异，Be，Cd，Cu，Fe，Mn，Ni，Sr，V和Zn的检出限均低于5 μg/L，而Cr，Ga，Pb和Sn检出限在8.184 8~16.041 4 μg/L之间，则总的检出限在0.089 3~16.041 4 μg/L之间，满足检测要求；线性范围均在0.1~1 000.0 μg/L之间，线性相关系数为0.990 1~1.000 0之间，该方法重复性D_RS均小于10%。由于原矿朱砂与水飞朱砂成分存在差异，鉴于原矿朱砂所含杂质远高于水飞朱砂，在进行胃液模拟仿生提取过程中，原矿朱砂和水飞朱砂的重复性存在一定差异，即水飞朱砂提取过程中的重复性明显优于原矿朱砂。精密度的D_RS均小于7.1%，加样回收率在83.0%~117.5%之间，该方法均满足朱砂原矿与水飞样品在胃液模拟过程中13种重金属可溶性含量同时检测的要求。

表4  方法学考察结果

Table 4  Inspection results of methodology

总之，能够通过方法学考察的元素共有13种，分别为Be，Cd，Cr，Cu，Fe，Ga，Mn，Ni，Pb，Sn，Sr，V和Zn。通过线性关系、检出限、精密度、重复性、加样回收率等方面的方法学考察，证明该方法在优化的实验条件下能够实现原矿和水飞朱砂可溶性重金属含量检测，为朱砂样品检测提供可靠性保障。

2.5  样品检测结果

通过实验过程中优化好的样品前处理技术(仿生提取-微波消解技术)对朱砂样品进行前处理，根据前面的实验步骤及相应的仪器测试条件对工艺流程中的5个朱砂样品(编号为H-1~H-5)对通过方法学的13种可溶性重金属进行检测，检测结果见表5。

表5  样品检测结果(质量分数, n=3次)

   Table 5  Results of samples(mass fraction, n=3)   mg/kg

根据表5所示结果，在通过方法学考察的13种元素中，Be，Cr，Cu，Ga，Ni和V质量分数均低于相应的检出限，说明在整个工艺过程中朱砂的这几个重金属质量分数很低，均未能检出。目前在实际应用中，未对可溶性重金属进行标准制定。对能检出的重金属进行分析，参照中华人民共和国对外贸易经济合作部“药用植物及制剂进出口绿色行业标准”^[17]规定重金属总量限量标准：Pb，Cd和Cu的质量分数分别为≤5.0 mg/kg，≤0.3 mg/kg和≤20.0 mg/kg。其中H-5的Cd质量分数高于0.3 mg/kg标准值，H-3，H-4和H-5样品的Pb质量分数超出标准值，H-5的Pb的质量分数高达22.98 mg/kg，并且通过淘洗、初球磨、再球磨、滤水、干燥、粉碎、包装等工艺，Pb的质量分数逐渐下降。这说明在整个工艺过程中，通过对朱砂的加工能够在一定程度上降低对人体具有毒性的Pb质量分数，达到减毒效果。目前并不存在针对矿物药的重金属总含量和可溶性含量的行业标准，该方法能够检测人体内消化环境中重金属的可溶性质量分数，为矿物药重金属含量的标准制定提供可靠的方法及参考。

3  结论

1) 仿生提取-ICP-OES法能满足13种重金属(即Be，Cd，Cr，Cu，Fe，Ga，Mn，Ni，Pb，Sn，Sr，V和Zn)同时检测要求，但朱砂中汞的检测结果可靠性较差，说明该方法对汞元素检测精密度不高，灵敏度偏低，检出限较高，未能通过方法学考察。针对朱砂中可溶性汞的检测，接下来拟采用灵敏度更高的分析方法即仿生提取-ICP-MS法进行检测。

2) 这13种重金属对朱砂用药的毒理药理作用尚未清楚，可溶性重金属质量分数有利于进一步研究朱砂药效机理等。从不同工艺流程所得朱砂样品分析，经过破碎、水飞等工艺，朱砂中的可溶性重金属质量分数呈逐步降低趋势，说明经过破碎、水飞等工艺过程可以减少朱砂中可溶性重金属的质量分数，从而实现减毒增效作用，保障朱砂的用药安全。

3) 参照各限量标准，仅有工艺流程中的H-3，H-4和H-5样品的Pb质量分数超出标准值，H-5的Cd质量分数超出标准值，这说明加工过程中通过破碎、淘洗、球磨、水飞等工艺可在一定程度上减少有毒有害重金属元素的可溶性质量分数，但仍需研究如何完善或者改进去除Pb的工艺，以确保朱砂质量安全。由于以参考的重金属限量标准为总量标准，对结果具有一定的局限性评价，因此，需对矿物药重金属的可溶性含量制定标准及增加其他重金属行业标准。

4) 仿生提取-ICP-OES法的建立可通过生产现场随时取样，实时监测不同工艺阶段朱砂可溶性重金属的质量分数，为进一步优化工艺流程提供可靠依据，不断完善并确定最佳的矿物药朱砂生产加工流程。

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(编辑  陈灿华)

收稿日期：2016-01-10；修回日期：2016-03-22

基金项目(Foundation item)：国家科技部十二五专项(2014ZX09304-307) (Project(2014ZX09304-307) supported by the National Major Scientific and Technological Project during 12th Five-year Plan Period)

通信作者：蒋秋桃，博士研究生，研究员，从事生物医学工程研究；E-mai: l 317095079@163.com