简介概要

金属毒性研究(Ⅱ)

来源期刊：中国有色金属学报2002年第1期

论文作者：阮建明 M.H. Grant 黄伯云

文章页码：14 - 19

关键词：金属毒性；DNA和GSH；细胞

Key words：metal cytotoxicity; DNA and GSH; cell

摘要：利用细胞生物学技术从定量和定性两个方面探讨了Cr(Ⅲ)，Cr(Ⅵ)，Ni，Al，Ag和V金属离子对生命组织的毒性作用。研究中发现，Cr(Ⅵ)对细胞DNA，RNA合成限制最为显著，Ni和V金属离子在同等水平上妨碍RNA合成，随着离子浓度增加，Cr(Ⅲ)离子对细胞DNA及RNA限制增大。Al离子对RNA合成限制大于对DNA合成。Ag离子对细胞DNA，RNA合成限制作用相同。细胞谷胱甘肽(GSH)还原能力强，是细胞最重要的解毒物质，也是细胞中防御毒性物质最关键的物质。细胞GSH还原能力定量分析表明：微量的Cr(Ⅵ)即可导致细胞GSH下降。金属Ni离子破坏细胞骨架，使细胞内信息传递受阻，亦表现较强毒性。

Abstract: By use of cellular biological techniq ues，the poison mechanism of metal ions (Cr(Ⅵ)，Ni，V，Cr(Ⅲ)，Ag，and Al) on livi ng tissue was both quantitatively and qualitatively approached. The re sults show that Cr(Ⅵ) has a notable action on cellular both DNA and RNA synth etic functions. With increasing concentrat ion，the limit action of Cr(Ⅲ)，on DNA，RNA synthetic abilities increases. Di fferent to oth er five metal ions，the limit of Al ion on RNA is greater than that of Al ion on DNA.The limitation of V，Ag ions on DNA is same to that of V,Ag ions on RNA. Glutathione is most important of detoxification in living cells. It is also the most important defensive. Trace Cr(Ⅵ)，in culture medium results in the decreasing of GSH in living tissue. Similar to that，a little higher Ni ion concentration seriously reduces the GSH content in living tissue. It is suggested that Cr(Ⅵ)，Ni should destroy and/or disturb the orientation of the microtubulin in cell skeleton. For other four metalions，together with increasing the concentration in culture medium， the osmotic pressure increases. Consequently，more metal ions entered cell membrane，more GSH were lost in cell.

DOI:10.19476/j.ysxb.1004.0609.2002.01.002

金属毒性研究 (Ⅱ)

阮建明 M.H.Grant

中南大学粉末冶金国家重点实验室

BioengineeringUnitStrathclydeUniversity

中南大学粉末冶金国家重点实验室长沙410083.BioengineeringUnit

StrathclydeUniversityGlasgowG4ONW

摘要：

利用细胞生物学技术从定量和定性两个方面探讨了Cr (Ⅲ ) , Cr (Ⅵ ) , Ni, Al, Ag和V金属离子对生命组织的毒性作用。研究中发现 , Cr (Ⅵ ) 对细胞DNA , RNA合成限制最为显著 , Ni和V金属离子在同等水平上妨碍RNA合成 , 随着离子浓度增加 , Cr (Ⅲ ) 离子对细胞DNA及RNA限制增大。Al离子对RNA合成限制大于对DNA合成。Ag离子对细胞DNA , RNA合成限制作用相同。细胞谷胱甘肽 (GSH) 还原能力强 , 是细胞最重要的解毒物质 , 也是细胞中防御毒性物质最关键的物质。细胞GSH还原能力定量分析表明 :微量的Cr (Ⅵ ) 即可导致细胞GSH下降。金属Ni离子破坏细胞骨架 , 使细胞内信息传递受阻 , 亦表现较强毒性。

关键词：

金属毒性;DNA和GSH;细胞;

中图分类号： R995

收稿日期：2000-12-27

Approach of metal cytotoxicity (Ⅱ)

Abstract：

By use of cellular biological techniques, the poison mechanism of metal ions (Cr (Ⅵ) , Ni, V, Cr (Ⅲ) , Ag, and Al) on living tissue was both quantitatively and qualitatively approached. The results show that Cr (Ⅵ) has a notable action on cellular both DNA and RNA synthetic functions. With increasing concentration, the limit action of Cr (Ⅲ) , on DNA, RNA synthetic abilities increases. Different to other five metal ions, the limit of Al ion on RNA is greater than that of Al ion on DNA. The limitation of V, Ag ions on DNA is same to that of V, Ag ions on RNA. Glutathione is most important of detoxification in living cells. It is also the most important defensive. Trace Cr (Ⅵ) , in culture medium results in the decreasing of GSH in living tissue. Similar to that, a little higher Ni ion concentration seriously reduces the GSH content in living tissue. It is suggested that Cr (Ⅵ) , Ni should destroy and/or disturb the orientation of the microtubulin in cell skeleton. For other four metal ions, together with increasing the concentration in culture medium, the osmotic pressure increases. Consequently, more metal ions entered cell membrane, more GSH were lost in cell.

Keyword：

metal cytotoxicity; DNA and GSH; cell;

Received： 2000-12-27

人们在日常生活和工作中常接触许多金属元素, 但往往只重视几种毒性很强的金属, 如镉, 汞, 铅 ^[1,2,3] , 等。实际上, 许多普通金属对生命肌体都有一定毒性。铝是我们接触最多的普通金属, 从事铝加工的人群中患老年痴呆症的人数是其他人群的29倍 ^[4,5] 。通过食物进入人体的金属被人体吸收后, 除极少量留下以维持生物体功能的正常代谢外, 其它大多数经酶解或络合后排泄掉。然而, 作为生物材料, 植入人体后直接接触体内组织, 可以离子、原子、分子、甚至颗粒的形态通透细胞膜, 进入细胞, 产生毒性反应 ^[1,6] 。最显著的反映是限制和破坏DNA, RNA合成 ^[6,7,8] , 表现为细胞增殖能力和蛋白质合成能力降低。谷胱甘肽 (GSH) 是细胞最重要的防御和解毒物质, GSH将有毒物质降解成无毒性物质, 由细胞蛋白质递解出细胞 ^[9,10,11] 。随着有毒物质进入细胞的数量增加, 细胞中GSH被消耗, 含量逐步减少。因此测定细胞GSH含量能够定量反映细胞毒性程度。作者在考察了金属离子对细胞酶活性和细胞代谢能力影响的基础上 ^[12] , 进一步研究了Ag, Ni, Cr, V和Al金属离子对细胞抗毒机构的破坏和金属离子对细胞DNA, RNA合成功能的限制。

1 实验

1.1 金属离子溶液制备

不同浓度的金属离子溶液分别从各自的金属盐溶液制得, 金属盐包括NiCl₂, AlCl₃, AgCl, VOCl₃, CrCl₃ (3价铬) , CrCl₂O₄ (6价铬) 。这些金属离子溶液与细胞培养基混合。对于动物细胞使用复合培养基 (DMEM) , 对于人骨细胞使用哈姆斯F-10培养基 (Hams F-10) 。培养基中的离子浓度范围在0.1～1 250 μmol/L。

1.2 细胞DNA, RNA合成能力分析

细胞种类和细胞准备方法如文献 [ 1] 所描述。本项研究继续采用经病毒转染的人类成骨细胞 (第8次至第12次传代) 及动物成骨细胞 (第24次至第32次传代) (Osteoblasts) 。细胞DNA, RNA合成能力测定在24孔板上进行。对于人骨细胞, 每井下种密度为5×10⁴, 对于动物细胞, 每井下种密度为2.5×10⁴。下种后24 h, 正常的培养基为金属离子的培养基替代, 接着再培养24 h。分别在同时含有金属离子和放射性同位素标定的胸腺嘧啶 (H⁺-Thymidine; Td) 和同时含有金属离子和放射性同位素标定的尿嘧啶 (H⁺-Uridine) 的培养基中培养48 h。经PBS溶液充分洗涤后, 细胞在含有1 mmol/L胸腺嘧啶脱氧核绀或尿嘧啶核苷的PBS溶液中处理30 min, 以清除细胞内非特性结合的H⁺-Thymidine或非特性结合的H⁺-Uridine。接下来, 每井细胞经2 mL浓度为0.5 mol/L的乙酸消化溶解24 h后用0.5 mL浓度为0.5 mol/L的氢氧化钠溶液中和。取0.5 mL上述消化液与4 mL闪烁剂混合, 在闪烁记数器上定量测取细胞DNA中H⁺-Thymidine和RNA中H⁺-Uridine。闪烁记数器上定量测定参数用 (每分钟放射性点数) d/m表示。

1.3 细胞GSH解毒能力测定

细胞GSH解毒能力测定同样在24孔板上进行。细胞种植密度与前相同。细胞先由正常培养基培养, 每隔48 h更新培养液。对于人骨细胞, 1周后, 在细胞出现凋零 (Apoptosis) 之前, 正常培养基由含金属离子的培养基替代, 接着培养24 h。对于鼠骨细胞96 h后, 在细胞出现凋零之前, 正常培养基由含金属离子的培养基替代, 接着培养24 h。每井细胞的GSH经200 μL 10%三氯已酸 (Trichloroacetic acid:TCA) 在室温条件下萃取10 min, 萃取液中的细胞碎片由离心沉淀法去除。取25 μL上层清液与2.3 mL PBS (pH8) , 100 μL磺基水杨酸溶液混合并将此混合液在暗室和室温条件下陈化30 min。 GSH含量荧光分析采用Hissin/Hilf方法在RF-5001PC荧光质谱仪上测得 ^[10] 。标准曲线取值范围在0～50 μmol/L GSH, 零值用水标定。在350 nm波长激发光和420 nm波长发射光下记录读数。

1.4 实验数据统计

所有数据收集下来, 在图上表示成平均值±标准误差。应用单因素方差分析评估所有实验数据统计显著性。实验时, 以不含金属离子的培养基作为对照组。细胞在37 ℃恒温箱中培养, 培养气氛是含5% CO₂的空气。

2 实验结果

2.1 细胞形貌观察

图1所示为第10次传代培养的人类成骨细胞相差显微镜形貌。在对照组中 (图1 (a) ) , 细胞生长状态呈现为正常, 细胞直径约在10～20 μm, 图中用星号标示的圆形细胞 (实际为球形) 正处于细胞核DNA合成状态, 即细胞生命周期中有丝分裂前期。细胞密集贴附在培养皿底盘上, 表现经SV40 病毒DNA转染, 人类成骨细胞经10次传代有很强的增殖能力。图1 (b) ～ (g) 依次是培养在含Al, Ag, Cr (Ⅲ) , V, Ni, Cr (Ⅵ) 离子培养基中的人类成骨细胞相差显微镜形貌, 其时, 金属离子浓度为500 μmol/L。很明显, 细胞数量也按上述顺序依次减少。结果表现不同金属离子对细胞增殖的影响。作者曾用红血球计数器 (Heamocytometer) 测定细胞数, 依照上述顺序, 每井细胞数分别为6.5×10⁵, 6.6×10⁵, 1.3×10⁴, 1.1×10⁴, 3.1×10³和3.3×10³。

2.2 金属离子溶液中细胞DNA, RNA合成能力

图2所示为不同金属离子及不同金属离子浓度对人类成骨细胞 (a) 和动物成骨细胞 (b) DNA合成能力的影响的定量分析结果。依照上述Al, Ag, Cr (Ⅲ) , V, Ni, Cr (Ⅵ) 的顺序, 当离子浓度超过1 mmol/L (85±14) %, 500 μmol/L (87±9) %, 250 μmol/L (79±17) %, 50 μmol/L (84±12) %, 10 μmol/L (77±15) %, 5 μmol/L (77±19) %时, 人骨细胞DNA合成能力受到抑制。金属离子浓度对动物成骨细胞DNA合成能力的影响大于对人类成骨细胞DNA合成能力影响。依照Al, Ag, Cr (Ⅲ) , V, Ni, Cr (Ⅵ) 的顺序, 与对照组之间存在显著统计性差异的离子浓度分别降低到1 mmol/L (78±12) %, 500 μmol/L (81±1) % 1 μmol/L (72±18) %。

图1 不同金属离子培养基中人类成骨细胞相差显微镜形貌

Fig.1 Morphologic observation of human osteoblasts in metal ion culture media

(a) —Comparison group; (b) —Al; (c) —Ag; (d) —Cr (Ⅲ) ; (e) —V; (f) —Ni; (g) —Cr (Ⅵ)

图2 细胞DNA合成定量分析

Fig.2 Quantitive determination of cellular DNA

(a) —TRO cells; (b) —THO cells

图3所示为不同金属离子及不同金属离子浓度对鼠类成骨细胞RNA合成能力的影响的定量分析结果。随着培养基中金属离子浓度增加, 细胞RNA合成能力受到限制, 但是限制的程度小于DNA, 除铝离子之外, 使得与对照组产生统计性显著差异的金属离子浓度提高。仍然依照Al, Ag, Cr (Ⅲ) , V, Ni, Cr (Ⅵ) 的顺序, 与对照组之间存在显著统计性差异的离子浓度分别750 μmol/L (77±16) %, 750 μmol/L (79±12) %, 500 μmol/L (71±15) %, 100 μmol/L (87±9) %, 100 μmol/L (82±13) %和10 μmol/L (90±7) %。类似的结果表现在人类成骨细胞RNA合成能力上。

2.3 细胞GSH测量

细胞对金属离子的反应的GSH定量分析结果如图4所示。每种金属离子都给出了4组数据, 表示与对照组比较产生显著差异前后的离子浓度。仍然以6价铬对细胞GSH含量的影响最为显著, 其离子浓度为10 μmol/L (89±7) %。接下来是镍和钒, 分别是50 μmol/L (77±17) %和100 μmol/L (84±7) %。产生显著毒性的3价铬离子浓度是500 μmol/L (79±11) %。导致细胞GSH含量下降的银离子, Al离子浓度则在1 mmol/L附近, 分别是1 mmol/L (74±11) %和1 mmol/L (87±8) %。与图4 (a) 中的数据比较, 注意到图4 (b) 中的数据, 显示金属离子对人骨细胞GSH含量的影响要小于作用于鼠骨细胞, 在与上述相同的金属离子浓度条件时, 除了钒与对照组之间仍有显著性差异, 其余均无显著差异。这种结果说明鼠骨细胞GSH对金属离子的敏感性高于人骨细胞GSH对金属离子的敏感性。

图3 动物细胞细胞RNA合成定量分析

Fig.3 Quantitive determination of TRO cellular RNA

图4 细胞GSH相对百分含量分析

Fig.4 Relative percents of cellular GSH

(a) —TRO cells; (b) —THO cells

3 讨论

核酸是携带生命遗传基因的基础物质, 由核苷酸组成, 根据其在细胞中的作用, 分为DNA 和RNA, 生命的具体运行由蛋白质体现。为满足各种需要, 细胞脱氧核糖核酸DNA提供复制各种蛋白质的基因链拷贝, 由细胞信使核糖核酸RNA携带进入细胞质, 并在那里经细胞质和高尔基器官等其它器官完成蛋白质的复制合成 ^[13,14] 。因此, DNA, RNA, 细胞质, 高尔基器官, 蛋白质构成一个极其精确的生命体系环节。环节中任何一个因素的缺陷都会导致细胞功能障碍。如果有毒金属离子穿膜进入RNA高分子并且与RNA表面识别位点结合, RNA携带基因链拷贝和自身复制的功能受损, 将导致细胞合成蛋白质的能力下降。另一方面, 如果有毒金属离子进入细胞DNA, 这里会有两种结果: 影响DNA提供复制各种蛋白质的基因链拷贝和影响DNA本身的合成。后一个因素直接妨碍细胞自己本身的增殖。因此, 细胞DNA, RNA的定量分析都能够表达金属离子对细胞的毒性作用。简单说来, DNA链由腺嘌呤 (A) , 鸟嘌呤 (G) , 胞嘧啶 (C) , 和胸腺嘧啶 (T) 4个硷基空间排列组合而成。 RNA链由腺嘌呤 (A) , 鸟嘌呤 (G) , 胞嘧啶 (C) , 和尿嘧啶 (U) 4个硷基空间排列组合而成。它们就像砖头一样, 严密而又准确地构成DNA, RNA移传基因大厦。利用高分子细胞生物学技术, 只要测定细胞中某种碱基对的含量, 就能够得到DNA或RNA确定值。本研究将已经放射性同位素标定的胸腺嘧啶或尿嘧啶引入细胞培养系统, 利用细胞DNA或RNA合成时将其组合进DNA或RNA, 然后用闪烁记数器定量测定样品, 反映DNA或RNA合成能力。如果因为金属离子的毒性存在, 妨碍放射性标定的胸腺嘧啶或尿嘧啶组合, 结果是样品中DNA或RNA合成数量减少。图2中的实验结果曲线和数据表明培养基中金属离子, 对细胞DNA合成具有限制作用, 特别是Cr (Ⅵ) 和镍离子。一个解释是镍离子在细胞生理周期的DNA合成阶段阻碍DNA合成 ^[16] 。另一个解释是Cr (Ⅵ) 离子进入细胞后, 破坏细胞骨架, 使得细胞中的信息传递受阻, 导致DNA合成障碍 ^[17] 。上述两个因素均使细胞增殖下降, 如图1所示。贵金属银表现出相对惰性, 直到溶液离子浓度高于500 μmol/L, DNA合成才受到影响, 在溶液离子浓度低于1 mmol/L, RNA合成不受影响。低浓度Cr (Ⅲ) 离子对RNA合成影响很小, 这可能与Cr (Ⅲ) 离子与培养基中的物质形成络合物, 不能进入细胞膜相关 ^[17] 。高浓度Cr (Ⅲ) 离子对DNA合成限制可能与Cr (Ⅲ) 离子形成络合物后, 为细胞表面蛋白质受体识别和结合, 堵塞了膜表面通道相关。同时, 随着离子浓度增加, 渗透压亦增加 ^[14,16] , 进入细胞的离子数量增加, 产生较大细胞毒性。研究数据还表明, 微量的铝对细胞DNA有促成作用, 但是, 高浓度Al离子对RNA合成限制大于对DNA合成限制。一种分析是微量的铝离子介入细胞内信息传递系统, 加快了信息传递, 刺激DNA合成 ^[18,19,20] 。然而过度的铝离子介入细胞内信息传递系统后妨碍RNA合成, 破坏了细胞内信息传递系统, 最终限制DNA合成。与上述细胞内毒性机制不同的是, V离子的毒性表现在妨碍细胞间的信息传递, 使得受细胞间信息调控的细胞克隆受阻导致细胞凋零。同时, 随着离子浓度增加, 渗透压亦增加, 部分V离子进入细胞, 产生毒性, 结果是分析样品的DNA, RNA同时减少。因此, 钒离子浓度-DNA合成关系曲线与钒离子浓度-RNA合成关系曲线非常相似。

谷胱甘肽GSH广泛地分布于活细胞, 且与许多生物功能相关。它的氧化形式是GSSG, 它的还原形式是GSH。 GSSG由谷胱甘肽还原酶还原成GSH。当GSH与从材料析出的亲电子物质反应后失去电子, 成为GSSG, 部分被分泌出细胞。这种氧化-还原的过程就是最重要的细胞解毒机理之一 ^[10,11] 。进入细胞的毒性物质愈多, 细胞中残留的GSH就愈少。研究结果表明, Cr (Ⅵ) 和镍离子都具有很强的毒性, GSH含量急骤降低。细胞与对照组产生显著差异的离子浓度分别在10 μmol/L, 50 μmol/L。接下来是V和Cr (Ⅲ) 。银, 铝直到很高离子浓度时GSH才降低。值得注意的是, 除了Cr (Ⅵ) , 其余5种金属离子在它们各自的低浓度时, GSH都高于对照组。这种现象很可能是受刺激的细胞加强了消除致亚死毒物剂量的防卫活性和对毒物的酶解, 增加了膜通道蛋白的合成, 促进毒物酶解后的分泌 ^[21,22] 。 Cr (Ⅵ) 离子和镍离子的毒性值得进一步研究, 很可能除了消耗细胞GSH, 还破坏细胞骨架, 作者曾用微管抗体标定细胞微管蛋白, 发现经含Cr (Ⅵ) 离子培养液培养的细胞, 与对照组比较, 无论是微管取向, 还是微管密度与对照组比较, 都存在差异 ^[23] 。

另一个值得注意的问题是上述研究数据显示, 作为异类同种骨, 鼠骨细胞较人骨细胞对金属离子的毒性敏感。特别是对表现细胞增殖的DNA合成能力影响显著。如对图2中的实验曲线50% DNA处引垂线交于浓度坐标, 即产生50%死亡率的药剂量 (D₅₀) 。仍以Cr (Ⅵ) , Ni, V, Cr (Ⅲ) , Ag, Al为序, 对于鼠骨细胞, D₅₀值分别是65 μmol/L, 250 μmol/L, 750 μmol/L, 1 mmol/L, 1 mmol/L和1.2 mmol/L; 对于人骨细胞, D₅₀值则分别是100 μmol/L, 375 μmol/L, 1 mmol/L, 1 mmol/L, >1.25 mmol/L和>1.25 mmol/L。二者间存在差别。其原因可能是在细胞增殖时期, 金属离子破坏细胞分蘖出来的两个球形姐妹细胞在培养盘底板上贴附 ^[11,22] 。因为鼠骨细胞增殖能力高于人骨细胞, 受影响的程度大于人骨细胞。