酶解法对提取虎杖中白藜芦醇的应用及工艺优化

向海艳，戴开金，罗奇志

(南方医科大学 药学院，广东 广州，510515)

摘  要：在酶法提取虎杖中白藜芦醇的过程中，对原料经酶解处理后的乙醇提取工艺进行研究。研究结果表明，最佳提取工艺条件是：体积分数为40%乙醇，以液固比20?1，在40 ℃提取40 min，提取次数为1次。与原料未经酶解处理的直接醇提法的提取工艺条件比较，原料经酶解处理后,可以在较低的乙醇浓度、较低的温度下，提取较短的时间即可达到较好的提取效果。经HPLC分析，从虎杖中提取白藜芦醇的得率达13.85 mg/g，粗提物中白藜芦醇纯度达22.7%。

关键词：酶处理； 提取工艺；白藜芦醇；虎杖

中图分类号：TQ91；Q949.744         文献标识码：A         文章编号：1672-7207(2008)04-0700-05

Optimization of extraction process for resveratrol from

Polygonum cuspidatum Sieb et Zucc after enyzmatic treatment

XIANG Hai-yan, DAI Kai-jin, LUO Qi-zhi

(School of Pharmaceutical Sciences, Southern Medical University, Guangzhou 510515, China)

Abstract: In the process of enzymatic extraction for resveratrol from Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc., the effect of ethanol extraction parameters on the resveratrol extraction yield after enzyme treatment was studied. The results show that the optimum conditions of the ethanol extraction after enzyme treatment are as follows: with 20 times amount of 40% (volume fraction) alcohol at 40 ℃, extracting for 40 min and just one time. Compared with extraction conditions without enzyme treatment, high extraction ratio of resveratrol can be reached at low concentration of alcohol, low temperature and in short extraction time after enzymatic treatment. And HPLC determination shows that in the optimized extraction process, the content of resveratrol and the purity of extraction product are 13.85 mg/g and 22.7%, respectively.

Key words: extraction process; enzymatic treatment; resveratrol; Polygonum cuspidatum Sieb et Zucc

白藜芦醇具有重要的生理活性和多方面的药理活性^[1-6]。近年来关于虎杖中白藜芦醇的提取文献报道较多^[7-11]。但采用酶法提取的报道不多。白藜芦醇在虎杖中主要以苷的形式存在，本文笔者曾采用酶法提取^[12]，将白藜芦醇苷转化成白藜芦醇苷元，使白藜芦醇的得率大大提高，与传统醇提工艺相比，提取率提高了近5倍，并对酶解工艺进行了优化，但对酶解后白藜芦醇的提取工艺未进行优化，仍然采用原料未经酶解处理时所确定的直接醇提工艺。目前，人们对原料经酶解法处理后的提取工艺进行优化的研究较少^[13]。为了更深入地研究酶法提取的技术优势，本文作者通过单因素实验，考察各因素对原料酶解前后提取效果的影响，并结合正交设计实验寻找最佳提取工艺条件及显著影响因素，以期为酶法提取虎杖中白藜芦醇工艺的产业化提供实验基础。

1  实  验

1.1  仪器、试剂与药品

仪器有：DSY-1-2孔恒温水浴锅，北京东震科学仪器厂制造；BT 8100高效液相色谱仪；BT 8200 UV检测仪。

试剂有：色谱分析用甲醇，为色谱纯；其余试剂为分析纯。

药材有：纤维素酶粗品(活力单位约为1 000 U/g)，由岳阳尤特尔生化有限公司提供；白藜芦醇(纯     度＞98%)对照品，购自美国Sigma公司；虎杖，购自湖南省九芝堂药材公司，经鉴定符合中国药典虎杖中有关规定^[1]。

1.2  实验方法

称取虎杖粗粉5.000 g，加入一定量纤维素酶和水，按文献[12]确定的最佳酶解条件进行酶解，然后，用布氏漏斗抽滤，滤渣用一定量的提取剂，在一定温度下提取一定时间，提取完毕，用布氏漏斗抽滤。将白藜芦醇提取液收集浓缩,去除溶剂，并冷冻干燥，得到白藜芦醇初产品。称取一定量的初产品，用甲醇溶解并稀释至一定刻度，然后，用微孔膜过滤制成样品溶液。用高效液相色谱法测定其含量和初产品纯度。

1.3  分析方法

采用反相高效液相色谱法对白藜芦醇进行测定。以保留时间定性，峰面积定量。

a. 色谱条件。色谱柱Kromasil-C₁₈ (其高×内径为200 mm×4.6 mm，填料粒径为5 μm )；流动相为甲  醇-水溶液(体积比41?59)；流速为0.6 mL/min；检测波长为303 nm；柱温为室温。

b. 标准曲线的绘制。称取2.5 mg白藜芦醇置于25 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，得白藜芦醇0.10 g/L的对照品储备液，备用。

精密吸取标准品储备液1.5，2.0，2.5，3.0和3.5 mL，分别置于25 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，制成不同浓度的标准品溶液。依次取6 μL混合标准品溶液进样，对每种浓度重复实验3次。按上述色谱条件测定，绘制出标准曲线，并计算回归方程。结果表明，白藜芦醇在0.036~0.360 μg范围内呈良好的线性关系。其线性回归方程及相关系数r为：

Y = 3 618 260 X-83 481. 6，r = 0.999 8。

式中：Y为峰面积积分值；X为标准品进样量，μg。

样品溶液按与标准曲线相同的色谱条件进样，每次进样6 μL，重复3次，根据峰面积计算样品溶液中白藜芦醇的含量。

2  结果与分析

2.1  提取剂对虎杖酶解料中白藜芦醇浸提率的影响

考察不同提取剂对白藜芦醇含量的影响，结果如表1所示。

表1　酶解处理前后不同提取剂对白藜芦醇含量的影响

Table 1  Effects of different extraction agents on content of resveratrol with and without enzyme treatment

从表1可以看出，虎杖原料经酶解处理后，4种溶剂均可提取白藜芦醇，溶剂对提取效果影响不大。未经处理时，乙酸乙酯对白藜芦醇的提取效果很差，但原料经酶解处理后，其提取效果与其他3种的提取效果相当。考虑到乙醇的无毒无污染，使用安全等因素，本研究选择乙醇为提取剂。

2.2  单因素实验

为直观地反映酶解前后的提取因素对提取效果的影响差异，对原料未经酶解处理的常规溶剂提取的单因素实验也进行了研究。

2.2.1  乙醇体积分数的影响

考察不同乙醇浓度对白藜芦醇含量的影响，结果如图1所示。可见，乙醇浓度对白藜芦醇在酶解前后的提取的影响趋势大致相同，提取效果均随乙醇浓度的增加而增加。但原料未经酶解处理时，提取效果受乙醇浓度影响较大，含量随乙醇浓度增大而增加，达到80%左右时，趋势变缓。而原料经酶解处理后，当乙醇体积分数达到40%时，白藜芦醇含量即可达到较高值，再增大乙醇体积分数，白藜芦醇含量增加不明显。因此，综合考虑成本因素，选择40%乙醇为提取剂。

1―酶解前；2―酶解后

图1  乙醇浓度对白藜芦醇含量的影响

Fig.1  Effects of ethanol concentration on content of resveratrol

2.2.2  温度的影响

考察不同提取温度对提取效果的影响，结果如图2所示。从图2可见，原料未经酶解时，温度对提取效果影响很大；随着温度升高，白藜芦醇的含量均随之增大，需在较高的温度(60 ℃)下才能达到较高的浸提率。但原料经酶解处理后，在较低的温度下(40 ℃)，白藜芦醇就达到了较高的浸提率，温度继续增加，反而因物质受热时间长而使白藜芦醇含量下降。

1―酶解前；2―酶解后

图2  温度对白藜芦醇含量的影响

Fig.2  Effects of temperature on content of resveratrol

2.2.3  液固比的影响

考察不同液固比(即提取剂体积V与原料虎杖粗粉的质量m之比)对白藜芦醇含量的影响，结果如图3所示。可见，液固比对白藜芦醇浸提率影响较大，随着溶剂量的增大，白藜芦醇的提取率增大。原料经酶解处理后，当液固比增大到18?1后，增加溶剂量，白藜芦醇含量增大不明显。

1―酶解前；2―酶解后

图3  液固比对白藜芦醇含量的影响

Fig.3  Effects of ratio of extraction agent volume to material mass on content of resveratrol

2.2.4  提取时间的影响

考察提取时间对提取效果的影响，结果如图4所示。可见，未经酶解处理的原料，需要较长的提取时间，才会达到较好的提取效果，当提取时间达到100 min后，白藜芦醇含量的增加才趋于缓慢，原料经酶解处理后，在较短的时间内(60 min)，就达到了较高的含量，延长提取时间，含量增加不明显，反而因长时间受热而造成白藜芦醇含量有所下降。

1―酶解前；2―酶解后

图4  提取时间对白藜芦醇含量的影响

Fig.4  Effects of extraction time on content of resveratrol

2.3  正交试验

在上述单因素实验的基础上，确定以40%乙醇为提取剂，考察提取温度、提取时间、液固比3个因素对白藜芦醇提取的影响，设计了4因素3水平的正交试验方案，以提取的白藜芦醇含量为考察指标，选用L₉(3⁴)正交表，进行正交试验,并对结果进行方差分析。因素水平表如表2所示，正交实验结果如表3 所示，方差分析如表4所示。其中：A为提取温度，℃；B为提取时间，min；C为液固比；D为误差。

表2　因素水平表

Table 2  Factors of orthogonal design

表3  正交实验结果

Table 3　Results of L₉(3⁴) orthogonal experiment

从表3可见，3 种因素对白藜芦醇提取效果的影响与单因素试验结果相同，从极差分析看，液固比对白藜芦醇提取率影响最大，其次为提取时间，提取温度对提取率影响较小。方差分析结果也表明提取液固比影响显著(F_0.05≥F＞F_0.1)，时间和温度对提取效果的影响很小(F＜F_0.25)。方差分析比极差结果更详细地说明了各因素的影响程度(见表4)。

表4　方差分析表

Table 4  Results of deviation square analysis

从提取因素对白藜芦醇提取效果的影响规律来看，液固比的影响最大，提取温度和提取时间的影响很小，表明虎杖原料经酶解处理后，细胞壁被破坏，内含物更易于溶解出来，有效成分的提取近似于溶解的过程，从而在较低的温度提取较短的时间即可完成提取，而提取剂的用量因直接影响物质的溶解量，因此其影响最大。

得到最佳提取条件为A₂B₂C₃：以体积分数为40%的乙醇水溶液为提取剂，液固比为20?1，在40 ℃下提取40 min。

2.4  提取次数的影响

在上述最佳条件下，对经酶解处理的虎杖原料进行提取，考察提取次数对提取效果的影响，结果如表5所示。可见，提取次数的增加，含量增加很少，表明按确定的工艺进行提取，提取1次即可。因此，综合考虑经济效益，以提取1次为佳。

表 5　提取次数对白藜芦醇含量的影响

Table 5  Effects of extraction times on content of resveratrol

2.5  提取工艺的确定

通过对各因素的考察，确定了酶法提取虎杖中白藜芦醇的乙醇提取工艺的最佳条件为：体积分数40%的乙醇，液固比20?1，在40 ℃提取40 min，提取1次。

2.6  2种提取工艺的提取效果比较

采用文献[9]所确定的常规溶剂提取工艺和本研究确定的乙醇提取工艺分别对酶解后的虎杖原料进行提取，结果如表6所示。可见，优化前提取液中白藜芦醇得率为12.13 mg/g，粗提物中白藜芦醇纯度为12.2%；优化后分别为13.85 mg/g和22.7%。工艺优化后，产品收率和纯度都比优化前的高。

表6  2种方法提取效果比较

Table 6  Comparison of two extraction technologies

3  结  论

a. 对虎杖经酶解法处理后白藜芦醇的提取工艺进行了研究，确定了最佳乙醇提取工艺如下：体积分数为40%的乙醇，液固比为20?1，在40 ℃提取40 min，提取1次。

b. 与原料未经酶解处理的直接醇提法相比，提取工艺条件要求降低。表明原料经酶解处理后，性能产生了一定的变化，提取相对容易，在较低的乙醇浓度、较低的温度下，提取较短的时间即可达到较好的提取效果，从而减少能耗，降低成本。而且工艺优化后，产品质量和收率均有所提高。

参考文献：

[1] 中华人民共和国卫生部药典委员会. 药典: 一部[M]. 北京: 化学工业出版社, 2000.
Pharmacopoeia Committee of Ministry of Health of People’s Republic of China. Pharmacopoeia of People’s Republic of China: Vol 1[M]. Beijing: Chemical Industry Press, 2000.

[2] 郜海燕, 于震宇, 陈杭君, 等. 白藜芦醇功能和作用机理研究进展[J]. 中国食品学报, 2006, 6(1): 411-416.
GAO Hai-yan, YU Zhen-yu, CHEN Hang-jun, et al. Progress in resveratrol biological activities and effective mechanism research[J]. Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology, 2006, 6(1): 411-416.

[3] 薛　岚. 中药虎杖的药理研究进展[J]. 中国中药杂志, 2000, 25(11): 651-653.
XUE Lan. Progress in the pharmacology study of Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc.[J]. China Journal of Chinese Materia Medica, 2000, 25(11): 651-653.

[4] Filip V, Plockova M, Smidrkal J, et al. Resveratrol and its antioxidant and antimicrobial effectiveness[J]. Food Chemistry, 2003, 83(4): 585-593.

[5] 潘明新, 王晓阳. 虎杖的化学成分及其药理作用[J]. 中药材, 2000, 23(1): 56-58.
PAN Ming-xin, WANG Xiao-yang. Chemical components and pharmacology of Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc. [J]. Journal of Chinese Medicinal Materials, 2000, 23(1): 56-58.

[6] 史 丽, 刘 燕, 许现辉. 白藜芦醇的生物活性研究进展[J]. 食品与药品, 2006, 8(11): 8-11.
SHI Li, LIU Yan, XU Xian-hui. Research progression of resveratrol on its physiology function[J]. Food and Drug, 2006, 8(11): 8-11.

[7] 许汉林, 付宜和, 高 鹏, 等. 虎杖中白藜芦醇的提取与分离工艺研究[J]. 时珍国医国药, 2006, 17(8): 1423-1424.
XU Han-lin, FU Yi-he, GAO Peng, et al. Study on extraction process of resveratrol in Polygonum cuspidatum[J]. Lishizhen Medicine and Materia Medica Research, 2006, 17(8): 1423-1424.

[8] 刘 丹, 汤海峰, 张三奇, 等. 虎杖中有效成分提取方法的研究[J]. 中成药, 2007, 29(4): 516-521.
LIU Dan, TANG Hai-feng, ZHANG San-qi, et al. The optim iza tion of extraction process for effective ingredients in Polygonum cuspidatum[J]. Chinese Traditional Patent Medicine, 2007, 29(4): 516-521.

[9] 向海艳, 周春山, 钟世安, 等. 虎杖中白藜芦醇的提取工艺[J]. 中南大学学报: 自然科学版, 2004, 35(6): 965-969.
XIANG Hai-yan, ZHOU Chun-shan, ZHONG Shi-an, et al. Extraction process of resveratrol from Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc.[J]. Journal of Central South University: Science and Technology, 2004, 35(6): 965-969.

[10] 张 敏, 曹 庸, 于华忠, 等. 虎杖白藜芦醇提取工艺的初步研究[J]. 林产化工通讯, 2004, 38(3): 6-8.
ZHANG Min, CAO Yong, YU Hua-zhong, et al. Preliminary study on extraction process of resveratrol from Polygonum csupidatum[J]. Journal of Chemical Industry of Forest Products, 2004, 38(3): 6-8.

[11] 刘树兴, 程丽英, 杨大庆. 虎杖中白藜芦醇与大黄素的综合提取[J]. 天然产物研究与开发, 2005, 17(5): 632-635.
LIU Shu-xing, CHENG Li-ying, YANG Da-qing. Comprehensive extraction of resveratroland emodin from Polygonum cuspidatum[J]. Natural Product Research and Development, 2005, 17(5): 632-635.

[12] 向海艳, 周春山, 陈龙胜, 等. 酶法提取虎杖中白藜芦醇新工艺研究[J]. 林产化学与工业, 2004, 24(4): 77-80.
XIANG Hai-yan, ZHOU Chun-shan, CHEN Long-sheng, et al. Study on enzymatic extraction of resveratrol from Polygonum cuspidatum[J]. Chemistry and Industry of Forest Products, 2004, 24(4): 77-80.

[13] 刘志强, 贺建华, 曾云龙, 等. 水相酶解法同时提取菜籽油和蛋白质——酶解后水浸提工艺研究[J]. 中国粮油学报, 2003, 18(6): 69-72.
LIU Zhi-qiang, HE Jian-hua, ZENG Yun-long, et al. Aqueous enzymatic extraction for rapeseed oil and protein—Study on technology of aqueous extraction after zymohydrolysis[J]. Journal of the Chinese Cereals and Oils Association, 2003, 18(6): 69-72.

收稿日期：2007-09-26；修回日期：2007-12-19

基金项目：广东省自然科学基金资助项目(06301187)

通信作者：向海艳(1974-)，女，湖南龙山人，博士，讲师，从事天然产物活性成分的提取与分离研究；电话：020-61648592；E-mail: haiyanx@21cn.com