PRGD/PDLLA/β-TCP/NGF复合神经导管的制备及其体外降解性能
王永红1,戴红莲2,严琼姣2,李世普2
(1. 武汉理工大学医院,湖北 武汉,430070;
2. 武汉理工大学 生物材料与工程研究中心,湖北 武汉,430070)
摘 要:将聚合物-RGD多肽接枝聚(乳酸-羟基乙酸L-赖氨酸,PRGD)与聚(D,L-乳酸,PDLLA)、β-磷酸三钙(β-TCP)、神经生长因子(NGF)复合制备的新型PRGD/PDLLA/β-TCP/NGF复合导管材料在37℃的磷酸缓冲溶液中进行降解试验,研究支架材料在体外降解过程中相对分子质量、质量、降解介质pH值、微观形貌的变化及NGF的释放规律。研究结果表明:NGF的释放量在30 d内可以达到诱导神经组织的功能;加入β-TCP,可以部分中和聚乳酸和PRGD降解产物的酸性,有效调节降解介质的pH值,使其维持在中性。 加入PRGD和NGF可促进复合膜的降解,PRGD/PDLLA/β-TCP/NGF复合材料比聚乳酸具有更好的降解性能。
关键词:RGD多肽接枝;聚(D,L-乳酸);β-磷酸三钙;神经生长因子;神经导管;降解
中图分类号:R318.08 文献标识码:A 文章编号:1672-7207(2009)02-0406-05
Preparation and degradation performance of PRGD/PDLLA/β-TCP/NGF composite nerve conduit
WANG Yong-hong1, DAI Hong-lian2, YAN Qiong-jiao2, LI Shi-pu2
(1. Hospital of Wuhan University of Technology, Wuhan 430070, China;
2. Biomedical Materials and Engineering Research Center, Wuhan University of Technology, Wuhan 430070, China)
Abstract: The PRGD/PDLLA/β-TCP/NGF composite nerve conduits were prepared by solvent evaporation method using poly {(lactic acid)–co-[(glycolic acid)-alt-(L-lysine)]}(PRGD), poly (D,L-lactide)(PDLLA), β-tricalcium(β-TCP) and nerve growth factor(NGF). The degradation performance of composite nerve conduits were studied by observing the variation of pH value of degradation medium and relative molecular mass, mass loss ratio, NGF releasing quantity and microstructure of the composite. The results show that the releasing quantity of NGF can achieve the function inducing nerve tissue growth within 30 d; β-TCP can neutralize the acidity produced by degradation of PDLLA and PRGD, availably adjusts pH value of degradation medium to keep at neuter. Adding PRGD and β-TCP can promote the composite to degrade, hence, PRGD/PDLLA/β-TCP/NGF composite has better biodegradation than PDLLA.
Key words: RGD-polypeptide grafting; poly (D,L-lactide); β-tricalcium; nerve growth factor; nerve conduit; degradation
周围神经损伤是临床常见的致残性疾病,其修复治疗一直是神经科学领域的热门问题。目前,人们着眼于研制可生物降解的人工神经导管来促进周围神经再生。聚乳酸( PDLLA)具有良好的生物相容性和可降解吸收性,已被美国食品与药品管理局(FDA)批准用于生产神经导管,但由于其降解产物偏酸性,易引起非感染性炎症,且细胞亲和性差,缺乏细胞识别信号,不利于雪旺细胞和轴突的迁移,很难达到自体神经移植的修复效果[1-5]。在生物材料上引入细胞可识别信号(如RGD多肽),赋予材料生物活性,通过生物识别和肌体的转导机制直接刺激生物反应,可引导细胞的粘附、增殖、分化和迁移[6-7]。周围神经再生不仅能恢复其结构,更重要的是能恢复其感觉和运动功能。实现功能性再生需要合适的引导环境和适当的神经再生生物因子,而具有神经元营养和促进并诱导受损神经纤维向靶区生长的生物活性因子是调节神经再生的关键因素之一[8-10]。另一方面,β-磷酸三钙(β-TCP) 也是一种具有良好生物相容性的生物活性材料,具有很强的亲水性和一定的碱性,有可能弥补聚乳酸的不足[11]。因此,本研究制备了RGD多肽接枝聚(羟基乙酸-L-赖氨酸-乳酸)(PRGD),将其与PDLLA,β-TCP和神经生长因子(NGF)复合以期发挥几种材料的综合优势,为周围神经修复提供理想的导管材料,并探讨PRGD/PDLLA/β-TCP/NGF复合型神经导管的降解性能及NGF的释放规律。
1 实 验
1.1 PRGD/PDLLA/β-TCP/NGF复合型神经导管的制备
以Nε-苄氧羰基-L-赖氨酸和溴乙酰溴为起始原料,合成单体3S-[4-(苄氧羰基氨基)丁基]-吗啉-2,5-二酮,将该单体与丙交酯聚合生成聚(乳酸-羟基乙酸-Nε-苄氧羰基-L-赖氨酸),再经催化氢解脱苄氧羰基制得聚(乳酸-羟基乙酸-L-赖氨酸),最后,通过L-赖氨酸的侧氨基引入短肽RGD,制得一种新型聚合物即RGD多肽接枝聚(乳酸-羟基乙酸-L-赖氨酸)。以乙酸乙酯为溶剂,分别加入浓度为85%、相对分子质量为10×104~15×104的聚乳酸,浓度为10%的PRGD,浓度为5%、平均粒径小于500 nm的β-TCP以及微量神经生长因子,经超声波分散,磁力搅拌,采用溶剂挥发法制备PRGD/PDLLA/β-TCP/NGF复合成膜(厚度为0.2 mm),经真空干燥至恒重。将膜按实验要求用自制的模具成管,导管内径为2 mm,长度为14 mm,厚度为0.2 mm。采用相同的方法制备PDLLA,PRGD/ PDLLA和PRGD/PDLLA/β-TCP导管。
1.2 复合材料中NGF的释放性能
将5块PRGD/PDLLA/β-TCP/NGF复合膜及导管分别浸泡于3.0 mL磷酸缓冲溶液中,封口,置于37 ℃恒温摇床中振荡孵育,振荡速度为60 r/min。在预定时间收集溶液,应用酶联免疫吸附剂测定法[12]对浸提液进行NGF定量测定。实验用的试剂盒是由武汉博士德生物工程有限公司提供的小鼠NGF ELISA kit,其所用的标准品为小鼠2.5S NGF。采用1500型酶标仪(Finland, Thermo Labsystems)测定450 nm处的光密度(Optical density)[13]。
1.3 降解实验
将所制备的PDLLA,PRGD/PDLLA,PRGD/ PDLLA/β-TCP和PRGD/PDLLA/β-TCP/NGF这4种膜材料各分为5组,干燥至恒重,称其初始质量m1,投放于玻璃瓶中,加入等量磷酸缓冲溶液(pH=7.4±0.2),于37 ℃恒温降解。采用不更换介质的方法进行降解实验。从材料放入PBS溶液1 h后开始,每周测定2次降解液的pH值,测定14 d,然后,每7 d测定1次,测定70 d,观察降解液的pH值的变化。
在第14,28,42,56,70和84 d时,从降解液中取出各组材料,用蒸馏水冲洗,用滤纸除去表面水分,经真空干燥后,溶于氯仿,采用Water 2690D型凝胶渗透色谱仪测定重均相对分子质量。
分别在不同的时间段(14,28,42,56,70和84 d),从降解液中取出材料,用蒸馏水冲洗,滤纸除去表面水分,真空干燥至恒重,称量得m2,质量损失率(Mass loss,ML) 为:ML=(m1-m2)/m1。最后,将降解84 d的导管材料真空干燥后,采用日本制造的JSM-5610LV型扫描电子显微镜(SEM),在20 kV下观察其形貌。
2 结果与讨论
实现功能性再生取决于3个基本要素:神经元胞体的存活及功能状态,轴突再生速率和靶区诱神经生长特性。三者均依赖于神经因子的调控,因此,在缺损部位较长时间维持NGF的释放非常重要。NGF体外释放量如图1所示。可见, PRGD/PDLLA/β-TCP/ NGF复合膜和导管的NGF释放规律基本一致,NGF可以持续释放至少30 d。NGF暴释发生在前3 d,第 1 d的释放量达到370.6 μg/L。NGF经过暴释后,释放速率逐渐减小,在第7~24 d之间每天的释放量稳定在1.5 μg/L左右。材料在第30 d释放的NGF还能被检测到,但含量较低,约为0.15 μg/L。研究表明,NGF的质量浓度达到0.1 μg/L即可刺激PC-12长出突[14-15],而30 d内NGF的释放量可以达到诱导神经组织的 功能。
图1 NGF体外释放量
Fig.1 Release mass of NGF in vitro
导管材料在降解过程中的pH值变化如图2所示。可见,前14 d所有材料的介质pH值都急剧下降,后期下降缓慢。由于小相对分子质量的PRGD可以迅速降解,使降解液的pH值明显下降,且PDLLA在降解过程中的可溶性酸性物质也会导致pH值下降。PRGD/ PDLLA在整个降解过程中pH值一直下降,而PRGD/ PDLLA/β-TCP和PRGD/PDLLA/β-TCP/NGF在降解过程中,pH值稍微上升,且pH值下降较PRGD/PDLLA和PDLLA的下降速度慢。这归因于β-TCP溶解所产生的碱性产物能中和PDLLA降解产生的酸性。这4种材料在降解后期,pH值基本能维持细胞生长的中性环境。
1—PDLLA; 2—PRGD/PDLLA;
3—PRGD/PDLLA/β-TCP; 4—PRGD/PDLLA/β-TCP/NGF
图2 导管材料在降解过程中降解介质pH值的变化
Fig.2 Relationship between pH value of medium and degradation time
导管材料在降解过程中重均相对分子质量的变化如图3所示。可见,纯PDLLA 导管和复合导管的降解都表现为先快后慢,在降解的前14 d,各组材料中的聚乳酸的重均相对分子质量急剧下降,而随后的 70 d内重均相对分子质量下降速度逐渐减小。由于在降解早期,材料浸入到PBS溶液中后,首先发生的是材料吸水,H2O分子扩散到材料内部,PDLLA主链首先断裂,使PDLLA降解加快,其相对分子质量大幅度降低,而随后因聚乳酸分子链逐渐变短,可能被水解的部位变少,其相对分子质量降低速度减缓。PDLLA的化学结构并不发生变化,但由于H2O的渗入,PDLLA链松弛,相对分子质量较大的聚乳酸分子迅速水解,而且分子链上每个酯键都可能被水解断裂,释放出—COOH,pH 值开始下降;随着水化部位的增多,分子链越长,被水解的部位也就越多,水解速率也增大,释放出的—COOH也更多,且随着降解体系中H+ 浓度的增大,酸催化能力加强,这2种效应共同导致介质聚乳酸降解初期pH值陡降,相对分子质量也大幅度降低,所以,在开始阶段降解快,表现为PDLLA的本体水解。随着降解的进行,其相对分子质量降低,这主要是小相对分子质量的分子降解所致,于是,降解速度减小。另一方面,由于β-TCP粒子与PDLLA基质间结合存在缺陷, 水分子较容易扩散进入材料内部, 使复合材料中PDLLA 降解速度比纯PDLLA的降解速度快,在同一时期,PDLLA相对分子质量最大,PRGD/PDLLA/β-TCP和PRGD/ PDLLA/β-TCP/NGF的相对分子质量次之,PRGD/ PDLLA的相对分子质量最小。从图2可知,降解介质的pH 值下降速度比PDLLA的相对分子质量下降速度小,说明PDLLA 分子链的断裂(降解)是随机的,并非降解一开始就产生可溶于水的相对分子质量较小的酸性物质;β-TCP对降解反应趋势没有影响,但复合材料中的PDLLA的降解速率均比纯PDLLA的大。
1—PDLLA; 2—PRGD/PDLLA/β-TCP;
3—PRGD/PDLLA/β-TCP/NGF; 4—PRGD/PDLLA
图3 导管材料在降解过程中重均相对分子质量的变化
Fig.3 Variation of relative molecule mass of materials with degradation time
当聚合物降解到一定程度时,其降解产物溶于降解介质中,使聚合物体系的质量减少。导管材料在降解过程中的质量损失率见图4。图4表明,这4种材料在前56 d质量损失较大,56 d后质量损失趋于平缓,但仍缓慢增加。在相同的时间点,PDLLA的质量损失最小,PRGD/PDLLA/β-TCP和PRGD/PDLLA/β-TCP/ NGF的质量损失次之,PRGD/PDLLA的质量损失最大,这是由于小相对分子质量的PRGD迅速降解导致复合材料的质量减少,并使降解介质的pH值下降,促进了复合材料的整体降解,而β-TCP在中性环境中的降解速度较小,介质中pH值下降促进β-TCP的降解,这也会导致复合材料质量损失率比纯PDLLA的高。
1—PDLLA; 2—PRDG/PDLLA/β-TCP;
3—PRGD/PDLLA/β-TCP/NGF; 4—PRGD/PDLLA
图4 导管材料在降解过程中的质量损失率
Fig.4 Mass loss of materials with degradation time
图5显示导管经过84 d降解后均有不同程度的降解。纯PDLLA 管和PRGD/PDLLA/β-TCP/NGF复合导管84 d后均匀降解,材料出现大量微孔。纯PDLLA表面的微孔明显比PRGD/PDLLA/β-TCP/NGF复合材料的小,且分布更均匀。由此可见,PRGD/PDLLA/ β-TCP/NGF复合材料的降解速度明显比纯PDLLA的降解速度快。这是由于PRGD和β-TCP的降解,NGF的释放以及β-TCP与PDLLA 基质间的结合缺陷导致该界面PDLLA快速降解。
(a) PDLLA(降解前);(b) PDLLA(降解84 d);(c) 复合导管(降解前);(d) 复合导管(降解84 d)
图5 PDLLA导管和PRGD/PDLLA/β-TCP/NGF复合导管降解前后的SEM表面形貌
Fig.5 Scanning electron microscope (SEM) images of surface morphology of PDLLA conduit and PRGD/PDLLA/β-TCP/NGF composite conduit before and after degradation
另外,PDLLA的降解依赖于其材料形态、化学组
成、结构、相对分子质量、材料尺寸、降解环境的性质等。Grizzi等[16]发现薄膜、粉末和微球与大型试样相比其降解速度要小很多。由于材料越薄,产生内外差异的可能性越低,其酸自催化加速降解效应小。总体来说,纯PDLLA 导管和复合导管体外降解84 d后,降解液pH值虽然降低,但仍呈微弱酸性,这与导管材料的管壁薄(0.2 mm),在降解过程中,酸自催化作用不很明显,降解速度相对小有关。
PRGD/PDLLA/β-TCP/NGF复合材料的降解是PGRD,PDLLA,β-TCP和NGF的综合作用:最初是小相对分子质量的PRGD迅速降解,导致降解介质的pH值下降,也促进了PDLLA降解;然后,PDLLA的本体降解,导致pH值急剧下降,其相对分子质量大幅度降低,但这并不能使PDLLA立即溶于PBS中,材料的质量损失有了滞后效应。因此,PRGD/PDLLA/ β-TCP/NGF复合材料在降解介质中虽然发生了溶胀,但外形结构在降解过程(0~84 d)中仍保持完整。在该复合材料中,由于表面分布有亲水性的NGF,可促进H2O分子向材料本体扩散,因此,NGF的引入促进了材料的降解。β-TCP在中性介质中的溶解度很低,但PRGD和PDLLA的降解使体系酸性增加而促进了β-TCP的降解,而其降解产物可起到一定的中和作用,有效缓解了PRGD和PDLLA降解产物的酸性,提高了复合导管的生物相容性。
对于生物可降解神经导管,材料的降解速度是一个非常重要的指标。间距为10 mm的神经再生需要2~3个月,因此,要求神经导管至少应维持3个月的支持作用后才逐步被降解吸收。本研究表明,PRGD/ PDLLA/β-TCP/NGF复合导管经84 d的降解后,虽然相对分子质量大幅度下降,质量损失率达到21.4%,材料表面也出现了大量微孔,但导管外形仍然保持完整,具有弹性。由此可见,PRGD/PDLLA/β-TCP/NGF复合神经导管不仅具有较好的生物降解性能,同时,达到神经修复期间的支持功能。
3 结 论
a. 通过L-赖氨酸的侧氨基引入短肽RGD合成了新型聚合物PRGD,将其与PDLLA,β-TCP和NGF复合,采用溶剂挥发法制备了新型的PRGD/PDLLA/ β-TCP/NGF复合神经导管。
b. PRGD/PDLLA/β-TCP/NGF复合神经导管中NGF的释放量至少在30 d内便可以达到诱导神经组织的功能。
c. β-TCP可以部分中和聚乳酸、PRGD降解所产生的酸性产物,有效调节降解介质的pH值,使其维持在中性。 加入PRGD和NGF可促进复合膜的降解,PRGD/PDLLA/β-TCP/NGF复合材料比PDLLA具有更好的生物降解性能。
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收稿日期:2008-11-16;修回日期:2009-01-20
基金项目:国家“973”重点基础研究发展计划资助项目(G2005CB623905)
通信作者:李世普(1946-),男,辽宁新民人,教授,博士生导师,从事生物医用材料的研究与开发;电话:027-87216470;E-mail: lishipu46@126.com