浮选难选赤铁矿的微生物捕收剂的筛选及性能评价
杨慧芬，李甜，唐琼瑶，王传龙，马雯
(北京科技大学 土木与环境工程学院，金属矿山高效开采与安全教育部重点实验室，北京，100083)
摘要：采用细菌培养基、浮选联合方法从铁矿采矿场土壤中筛选出4株对赤铁矿具有较高回收率的微生物，并对其进行16SrDNA全序列分类鉴定，对其中一株F3为无致病性的微生物的表面形貌、组成、表面Zeta电位、疏水性及其作用前后赤铁矿表面的Zeta电位、疏水性以及在赤铁矿表面的吸附机理进行分析。结果表明，细菌培养基、浮选联合方法是一种高效的从采矿场筛选微生物捕收剂的方法，4株微生物对赤铁矿回收率均在75%以上。F3为Stenotrophomonas菌属的一株微生物，为短杆状细菌。该细菌表面既含有非极性的CH2基团和CH3基团，又含有极性的磷酸基团，因而表面呈现较高的负电性和较大的疏水性。F3在赤铁矿表面的吸附，降低了赤铁矿表面的Zeta电位，提高了赤铁矿表面的疏水性，主要为化学吸附。因此，微生物F3适合作为赤铁矿的捕收剂使用。
关键词：微生物；捕收剂；浮选法；筛选；性能评价；赤铁矿
中图分类号：TD-05；TD951；Q937.97；X506 文献标志码：A 文章编号：1672-7207(2013)11-4371-08
Screening and performance evaluation of microbial collector for refractory hematite flotation
YANG Huifen, LI Tian, TANG Qiongyao, WANG Chuanlong, MA Wen
(State Key Laboratory for High-Efficient Mining and Safety of Metal Mines of Ministry of Education,
School of Civil and Environmental Engineering, University of Science and Technology Beijing, Beijing 100083, China)
Abstract: Four microbial strains, with high recovery rate to pure hematite, were screened from the soil in an iron mine using combined methods of bacterial culture medium and flotation. And the full 16SrDNA sequence classification and identification of the four strains were carried out. The micrograph, composition, Zeta potential and hydrophobic of F3 strain were comprehensively evaluated respectively. The Zeta potential and hydrophobic of hematite surface before and after adsorbed by F3 and its adsorption mechanism were also analyzed. The results show that combined method is an effective screening method to obtain bio-collector from iron mine. More than 75% hematite is recovered using the four strains as collectors for hematite flotation. F3 strain is a short rod-shaped and a stenotrophomonas bacterium, which has detected with CH2, CH3 groups and phosphate groups on the cell wall, showing strongly hydrophobic and highly negative charged. Due to adsorption of F3 strain, Zeta potential of hematite surface is reduced, and hydrophobic is enhanced. The adsorption of F3 on hematite surface is dominantly chemical adsorption. Therefore, F3 strain can be used as bio-collector for hematite flotation.
Key words: microorganism; collector; flotation; screening; performance evaluation; hematite
我国赤铁矿石储量丰富，但主要以品位低、嵌布粒度细和结合形态复杂的“难选矿”形式存在。这种“贫、细、杂”的特点，使得开采出来的赤铁矿石绝大多数需要细磨到80%~90%的矿石粒度小于75 μm，个别地区矿石需细磨到90%以上的矿石粒度小于45 μm，其中的铁矿物才能获得单体解理而分选。目前，对如此细磨“难选矿”处理的最有效方法是浮选，但常规浮选的浮选效果很差，通过高分子絮凝或疏水絮凝增大矿物浮选粒径是提高浮选效果的重要方法[1]。赤铁矿的高分子絮凝-浮选最成功的工业应用为美国Tilden 选厂[2]，该厂采用淀粉使微细粒赤铁矿絮凝成大颗粒，再通过脱泥去除硅质矿泥，阳离子捕收剂反浮选去除粗颗粒的硅质脉石而获得铁精矿。但选择性絮凝具有机械夹带、对矿浆离子变化敏感、需极稀矿浆分选等弱点，限制了它的实际应用。疏水絮凝主要是通过加表面活性剂类物质如捕收剂等，使目的组分先形成疏水絮团再浮选回收[3]。如用十二烷基胺醋酸盐作为赤铁矿的絮凝-捕收剂，可使微细粒赤铁矿的回收率较常规浮选的回收率提高20%~30%[4]。疏水絮凝-浮选具有较高的选择性，因而表现出良好的应用前景。但常规化学捕收剂对微细粒赤铁矿的选择性差、药耗高、价格贵以及药剂环境污染严重仍是极大弊端。因此，研究高效无污染或少污染的赤铁矿捕收剂是解决我国贫赤铁矿利用问题的迫切要求，而微生物捕收剂的研究则是解决上述难题的一个重要方向[5]。
自然界存在的许多微生物表面有不同程度的带负电性和润湿性[6]，具有常规表面活性剂类捕收剂的类似性能，能与捕收剂一样吸附在矿物表面，并以其本身性质调整或改变矿物表面的电性和疏水性。表面疏水的微生物一旦吸附在微细粒矿物表面，不但可导致微细粒矿物表面的疏水化，还可使疏水的矿物颗粒互相吸引成疏水聚团。最早提出微生物捕收剂研究的是美国雷诺大学的Smith[6]，最早得到研究的微生物捕收剂是草分枝杆菌(Mycobacterium phlei)[6-9]，这种微生物能使微细粒赤铁矿颗粒形成疏水絮团而浮选回收。因此，各国研究人员也开始积极寻找各种性能类似于M.phle的微生物用于赤铁矿及其他矿物的浮选。目前，已研究的可用作赤铁矿捕收剂的微生物包括：Bacillus polymyxa[10-11]，Paenibacillus polymyxa[12]，Rhodococcus opacus[13-14]，Bacillus subtilis[15]和红城红球菌[16]。这些微生物与M.phle一样，同样具有使微细粒赤铁矿颗粒形成疏水絮团而浮选的作用。
但是从环境中筛选针对某种矿物浮选的特效微生物捕收剂的研究较少。现有微生物的筛选方法均是依靠微生物本身的特性和生理功能，采用选择培养或平板稀释分离法。浮选赤铁矿的微生物捕收剂的筛选也必须以这些方法为基础，再根据微生物的捕收特性来筛选。在浮选过程中，只要能吸附于赤铁矿表面并引起赤铁矿表面疏水性的微生物，都可以作为赤铁矿的捕收剂使用，但只有那些吸附能力强、足以使赤铁矿表面疏水并形成疏水絮团、且无致病性的微生物才能作为微细粒赤铁矿的特效捕收剂使用。本文作者利用现有一般的微生物筛选法与浮选法结合，从铁矿采矿场土壤中筛选一株对微细粒赤铁矿浮选具有特效的微生物捕收剂，并对这株微生物进行细胞形状、细胞壁组成、Zeta电位、疏水性及其与赤铁矿作用引起的赤铁矿表面Zeta电位、疏水性变化、作用机理等全面分析和评价，以期为我国难选赤铁矿的浮选提供一种环境友好的特效微生物捕收剂。
1 实验
1.1 实验原料
浮选用赤铁矿购自中国地质博物馆，铁质量分数为68.11%。将购回的赤铁矿破碎至粒度小于2 mm，用2%(质量分数)盐酸溶液浸洗，再用瓷球磨干磨至粒度小于30 μm，装于磨口玻璃瓶备用。
筛选微生物捕收剂的土壤取自河北司家营铁矿采矿场附近，采用对角线法采集距离地面5~15 cm处的土壤。所采土壤均匀混合后装入灭菌的封口聚乙烯袋，低温保存备用。
所用培养基为细菌培养基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，琼脂质量分数15%~30%，蒸馏水1 000 mL，pH 7.0~7.2，对土壤中细菌进行选择性培养。
1.2 实验方法
采用细菌培养基结合浮选的方法从采场土壤中筛选浮选赤铁矿的特效微生物捕收剂。
首先采用细菌培养基对取回的土壤试样进行细菌选择培养。称取经除杂的土壤试样10 g，加入盛有90 mL无菌水的三角瓶中，置于30 ℃的摇床中以转速为200 r/min振荡20 min，静置，获得上清液。按5%的接种量将上清液接种于细菌液体培养基中，摇床培养24 h，再按同样方法转接2次，离心、洗涤获得土壤混杂细菌。在甘油管中保存土壤混杂细菌，剩下的菌液置于4 ℃冰箱中备用。
土壤混杂细菌通过浮选初筛淘汰对赤铁矿没有吸附作用或有吸附作用但不足以引起赤铁矿表面疏水性的细菌，再利用细菌培养基进行细菌液体培养、平板培养，获得单菌体。最后再对每一单菌体进行浮选复筛，获得一株对赤铁矿浮选具有较高回收率的菌体。采用SEM、红外光谱、Zeta电位、接触角测定等方法对确定的这株微生物捕收剂进行分析。
浮选试验在25 mL小型浮选槽中进行，采用一段浮选流程。人工刮泡，浮选用水为蒸馏水，充气量为2 600 r/min。称取2 g赤铁矿，加入具有去离子水的浮选槽中搅拌2 min，用1 mol/L HCl或1 mol/L NaOH调浆至设定pH，再加入微生物搅拌10 min，刮泡5 min。上浮产品过滤、烘干、称重，计算赤铁矿的回收率，并根据回收率筛选浮选赤铁矿的微生物捕收剂。
微生物捕收剂的形貌及其吸附后赤铁矿表面的状态用Quanta 200 扫描电子显微镜(SEM)观察。观察前，试样反复离心洗涤，再用临界点干燥法干燥后进行喷金处理。
微生物捕收剂表面及其作用前后赤铁矿表面的基团，用Nicolet 6700红外光谱分析仪分析。分析前试样进行多次洗涤，并在真空度-0.1 MPa干燥箱中干燥24 h。
微生物捕收剂及其作用前后赤铁矿表面的Zeta电位，用Zeta电位分析仪(Zeta-potential Analyzer ver5.57)测定。测定时，菌体和赤铁矿质量浓度均为100 mg/L，预先分散在浓度为0.01 mol/L的NaCl溶液中，并调节pH至设定值。
微生物捕收剂及其作用前后赤铁矿表面的疏水性，用JY-82型接触角测定仪测定。将培养28 h的菌体离心收集、无菌水洗涤2次，用0.45 μm硝酸纤维素膜过滤直到滤膜上菌体浓度大于108 个/mm2，再将滤膜平铺在无菌琼脂培养基上室温放置2 h润湿均匀，然后放在普通滤纸上干燥，干燥后的滤膜放到接触角测量仪上测量。将3 g微生物捕收剂作用前后的赤铁矿在直径×高度为100 mm×50 mm模具中压片，带模进行接触角测定，获得相应条件下的接触角。
1.3 菌种鉴定
将筛选所得到的细菌培养20 h后，取其新鲜菌液进行菌株DNA的提取，并对其进行16S rDNA PCR扩增，将所获的16S rDNA序列应用BLAST程序与Gen Bank数据库中的已知细菌16S rDNA序列进行同源性比较，以鉴定菌种归属。
2 结果与讨论
2.1 土壤混杂细菌的浮选初筛
土壤混杂细菌中适合作为赤铁矿捕收剂使用的微生物在浮选过程中与赤铁矿一起进入上浮产品，浮选槽中的微生物则为淘汰的微生物。图1所示为土壤混杂细菌用量对赤铁矿浮选回收率的影响。可见，随着土壤混杂细菌用量的增大，赤铁矿的回收率先迅速增大而后逐渐减小，回收率最高的混杂细菌质量浓度为500 mg/L，说明土壤混杂细菌中有能吸附在赤铁矿表面并使赤铁矿表面足够疏水化的微生物。但从用量来看，土壤混杂细菌中有相当部分不对赤铁矿起浮选作用，可通过浮选赤铁矿所淘汰。
图1 土壤混杂细菌质量浓度对赤铁矿浮选回收率的影响(pH=7)
Fig.1 Effect of soil mixed microbial concentration on hematite recovery (pH=7)
微生物在赤铁矿表面的吸附受溶液pH的影响。图2所示为土壤混杂细菌为捕收剂质量浓度为500 mg/L时，溶液pH对赤铁矿浮选回收率的影响。可见，土壤混杂细菌浮选赤铁矿时，溶液pH对赤铁矿的浮选回收率影响较大。过高过低的pH对赤铁矿浮选回收率的提高均有不利影响。说明土壤混杂细菌中，适合作为捕收剂使用的微生物只在一定的溶液pH范围起作用，浮选赤铁矿的最有利pH范围为6左右。
图2 溶液pH对赤铁矿浮选回收率的影响
Fig.2 Effect of solution pH on hematite recovery
2.2 浮选初筛微生物的平板分离
初筛虽然可淘汰大量的不适合作为赤铁矿捕收剂使用的微生物，但初筛获得的微生物仍然不是单一的，而是混杂微生物。为获得单一微生物捕收剂，采用在土壤混杂细菌质量浓度为500 mg/L和pH=6条件下初筛获得的上浮产品进行细菌液体培养、平板分离培养。图3所示为土壤混杂细菌及其浮选初筛后获得的微生物的平板菌落比较。可见，土壤混杂细菌，经浮选初筛后，菌落数明显减少，从初筛前的几百个菌落减少到仅9个菌落。说明浮选初筛可淘汰大量对赤铁矿没有吸附作用或有吸附作用但不足以引起赤铁矿表面疏水性微生物，因此是一种高效的从土壤中筛选浮选用微生物的方法。
挑取浮选初筛获得的9个微生物菌落，在细菌液体培养基中放大培养，再在固体琼脂平板上划线分离、纯化，得到9株单菌种(见图4)，分别命名为F1~F9。可见，9种单菌株菌落大小和形状均不同，其中F9，F8，F4，F2菌落较大且菌落数量较多，F1，F6菌落较大但菌落数量较少，F3，F5，F7菌落最小菌落数量不等。
图3 土壤混杂细菌浮选初筛前后的平板菌落比较
Fig.3 Microbial colonies before and after initial screening using flotation method
图4 浮选初筛后获得的9种单菌株的菌落
Fig.4 Nine single strains before initial screening using flotation method
2.3 9种单菌株的浮选复筛
9种单菌株哪种最适合作为赤铁矿的浮选捕收剂使用，通过浮选法进行复筛，以选择赤铁矿回收率较大者。图5所示为单菌株质量浓度对赤铁矿浮选回收率的影响。可见，9种单菌株用量对赤铁矿回收率的影响趋势相同，均是随着单菌株用量的增大，赤铁矿的回收率先增大后减小。但不同单菌株对赤铁矿回收率的影响不同，在单菌株质量浓度为60 mg/L时，赤铁矿回收率从大到小依次为：F9，F6，F8，F3，F4，F7，F2，F1，F5。回收率大，说明了单菌株对赤铁矿的吸附能力大，吸附引起的赤铁矿表面疏水性也大，因此作为赤铁矿捕收剂应用的可能性大。
图5 单菌株质量浓度对赤铁矿浮选回收率的影响
Fig.5 Effect of single microbial concentration on hematite recovery (pH=6)
图6所示为单菌株作为捕收剂质量浓度为60 mg/L时，溶液pH对赤铁矿浮选回收率的影响。可见，单菌株浮选赤铁矿时，溶液pH对赤铁矿的浮选回收率影响较大。pH过高或过低对赤铁矿浮选回收率均起抑制作用，最有利于单菌株在赤铁矿表面吸附并提高赤铁矿表面疏水性的pH为6。不同单菌株在不同pH下对赤铁矿的回收率影响不同，当pH=6时，回收率从大到小依次为：F9，F6，F8，F3，F7，F4，F2，F1，F5。
图6 溶液pH对单菌株浮选赤铁矿的影响
Fig.6 Effect of solution pH on hematite recovery
因此，不论单菌株用量还是溶液pH如何变化，用F9，F6，F8，F3单菌株浮选赤铁矿时，赤铁矿回收率始终位于前4位，且在单菌株质量浓度60 mg/L、溶液pH=6时，赤铁矿的回收率均达75%以上。为了获得回收率高又无致病性的微生物，依次对这4种单菌株进行扩增序列的16SrDNA全序列分类鉴定，并登陆NCBI网站，将所获的16S rDNA序列应用BLAST程序与Gen Bank数据库中的已知细菌16S rDNA序列进行同源性比较，结果见表1。
黏质沙雷氏菌属、不动杆菌属、沙雷氏菌属菌株同为临床上常见的致病菌，而寡养单胞菌属菌株的致病性报道极少，且已见应用于污水处理等环境过程中[17]。因此，淘汰F9，F8，F6这3株致病性的微生物，选取不致病性的F3为浮选赤铁矿的微生物捕收剂。图7所示为利用GenBank对与菌株F-3同源性较高的16S rDNA序列进行多重比较，利用分析软件MEGA及clustalx进行系统发育树的构建，并采用距离依靠法中的邻位相连法(Neighbor Joining)构建的F3系统发育进化树。
表1 4种单菌株的16S rDNA全序列分类鉴定结果
Table 1 Full 16S rDNA sequence classification and identification of four strains
图7 菌株F3与参考菌株基于16S rDNA序列构建的系统发育树
Fig.7 Phylogenetic tree constructed by F3 and reference strains based on 16S rDNA sequence
2.4 微生物捕收剂的性能鉴定
通过对F3单菌株进行细胞形状、细胞壁组成、Zeta电位、疏水性及其对赤铁矿作用引起的赤铁矿表面Zeta电位、疏水性变化、作用机理等全面分析和评价，获得这种微生物作为捕收剂应用的全面信息。
图8所示为F3单菌株的细胞外形。可见，F3为杆状细菌，其细胞尺寸为(2~4) μm×0.5 μm。
图8 F3单菌株的细胞外形
Fig.8 SEM micrograph of F3 strain
图9所示为F3单菌株细胞壁的红外光谱。可见，在红外光谱图中出现了不同基团的振动峰。在3 303.45 cm-1出现了羟基(OH—)的宽幅伸缩振动峰，在2 928.79 cm-1处出现了CH2和CH3基团的伸缩振动峰，在1 641.15 cm-1处为C=O的伸缩振动峰，在1 542.21 cm-1处为NH的弯曲振动峰，在1 454.66 cm-1处为CH的弯曲振动峰，在1 395.17 cm-1处为CH2和CH3基团的弯曲振动峰，在1 236.42 cm-1处为C—O—C的复杂振动峰，在1 074.97 cm-1处为磷酸基的反对称伸缩峰。其中，CH2和CH3基团造成菌体表面的疏水性，磷酸基团造成菌体表面的亲水性。因此，F3单菌株表面的性质类似于脂肪酸类捕收剂，有作为赤铁矿的捕收剂使用的先天条件。经测定，F3单菌株表面的接触角为69.57°。
图9 F3单菌株细胞壁的红外光谱
Fig.9 Infrared spectra of F3 strain cell wall
图10所示为F3单菌株及其吸附前后赤铁矿的Zeta电位曲线。可见，F3单菌株表面具有较高的负电性，在pH=3~10时，其表面的Zeta电位始终小于0 mV。赤铁矿表面的Zeta电位则随着溶液pH的增大从正变成负，pH为5.5左右时，赤铁矿表面的Zeta电位为0 mV(零电点，IEP)。因此，在中性偏酸性的pH范围，带负电的F3单菌株均有可能吸附于赤铁矿表面。
图10 F3单菌株及其吸附前后赤铁矿的Zeta电位
Fig.10 Zeta-potentials of F3 strain and hematite before and after adsorbed by F3
F3单菌株在赤铁矿表面的吸附降低了赤铁矿表面的电位，使赤铁矿表面零电点时的pH从吸附前的5.5降低到了4.3，也使得赤铁矿表面电位在溶液pH=3~6，均接近于0 mV。根据DLVO理论，表面电位接近于0 mV的赤铁矿颗粒互相之间的吸引力最大，最容易形成絮团。
F3单菌株在赤铁矿表面吸附降低其表面电性的同时，也必定会以本身疏水性调整赤铁矿表面的疏水性。经测定，赤铁矿本身的接触角仅20°，在F3质量浓度60 mg/L时，赤铁矿表面的接触角达到58.6°。因此，F3单菌株在赤铁矿表面的吸附，不仅增大了赤铁矿表面的疏水性，也容易在其表面电位0 mV附近形成疏水絮团，提高赤铁矿颗粒的可浮性。
图11所示为F3单菌株在赤铁矿表面和赤铁矿颗粒间吸附SEM像。可见，F3单菌株在赤铁矿表面的吸附，有单个细菌的吸附，也有多个细菌的吸附。吸附于赤铁矿表面的细菌互相吸引，象“架桥”一样将赤铁矿颗粒联为一体，形成赤铁矿絮团。
图12所示为 F3单菌株吸附前后赤铁矿的红外光谱。可见，赤铁矿经F3单菌株吸附后，表面多了3个F3单菌株所具有的特征振动峰，但这些振动峰的位置已发生了位移。如，在3 455.87 cm-1处的OH—伸缩振动峰发生了左移，在1 633.44 cm-1处的C=O的伸缩振动峰发生了右移，在1 078.03 cm-1处的磷酸基的反对称伸缩峰发生了左移。图9中的其他振动峰在图12中很难看到。此外，F3在赤铁矿表面的吸附，降低了赤铁矿本身固有的基团Fe—O在762 cm-1处产生的伸展振动峰。说明F3单菌株在赤铁矿表面发生了吸附，且吸附以化学吸附为主，包括磷酸基与矿物表面的化学作用、疏水的赤铁矿、赤铁矿颗粒之间的疏水缔合作用等。正是F3单菌株在赤铁矿表面的吸附具有化学吸附的特点使得F3单菌株对赤铁矿的浮选具有较高的回收率。
图11 F3吸附后赤铁矿表面的SEM像
Fig.11 SEM images of F3 strain on hematite
图12 F3菌株吸附前后赤铁矿的红外光谱
Fig.12 Infrared spectra of hematite before and after treated by F3 strain
3 结论
(1) 采用细菌培养基结合浮选赤铁矿的方法，从铁矿采矿场土壤中筛选得到了一株对赤铁矿浮选回收率较高、又不致病的微生物捕收剂F3。
(2) F3微生物为杆状细菌，表面既含有疏水性的CH2和CH3基团，又含有亲水性的磷酸基团，具有脂肪酸类捕收剂的类似组成和性质。
(3) F3微生物，表面具有较大的负电性和疏水性。经测定，F3表面的接触角为69.57°，在pH 6的Zeta电位为-27.8 mV。
(4) F3中的基团在赤铁矿表面发生了吸附，包括磷酸基与矿物表面的化学作用、疏水的赤铁矿、赤铁矿颗粒之间的疏水缔合作用等。
(5) 采用培养基结合浮选的方法从环境中筛选针对具体矿物浮选的微生物捕收剂，这种筛选方法简单、高效。
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(编辑 赵俊)
收稿日期：2012-10-19；修回日期：2013-01-10
基金项目：国家自然科学基金资助项目(51074017)
通信作者：杨慧芬(1964-)，女，浙江桐庐人，博士，教授，从事复杂难选矿分离工艺及固体废物综合利用研究；电话：13691283453；E-mail: yanghf@ustb.edu.cn
