DOI: 10.11817/j.issn.1672-7207.2019.01.006

银/稀土元素/碳微球抗菌剂的制备与表征

包芮于，余燕敏，张琴琴，王兴欣，陈慧英，夏建新，李华

(中央民族大学 生命与环境科学学院，北京，100081)

摘要：以水热法合成的碳微球(carbon microspheres，CMSs)为载体，通过在硝酸银溶液和稀土硝酸盐溶液中浸渍使银和稀土元素吸附在碳微球上，得到载银碳微球抗菌剂(Ag/CMSs)和载银/稀土元素碳微球复合抗菌剂(Ag/Re/CMSs)。通过扫描电子显微镜(SEM)、Ｘ线衍射分析仪(XRD)、X线光电子能谱(XPS)、透射电子显微镜(TEM)和红外吸收光谱(FTIR)对产物的形貌和结构进行表征；采用抑菌环法，以大肠杆菌、白葡萄球菌和枯草芽孢杆菌为实验菌种对抗菌剂的抗菌性能进行定性分析。研究结果表明：使用水热法制备的碳微球表面光滑，粒径均一，单分散性良好；Ag/CMSs和Ag/Re/CMSs抗菌剂对大肠杆菌、白葡萄球菌和枯草芽孢杆菌均有很好的抑菌效果，其中负载银和铈的碳微球(Ag/Ce/CMSs)具有最强的抗菌效果。

关键词：碳微球；银；稀土元素；抗菌性能

中图分类号：X172        文献标志码：A         文章编号：1672-7207(2019)01-0038-06

Preparation and characterization of silver/rare earth elements/carbon microspheres antibacterial agents

BAO Ruiyu, YU Yanmin, ZHANG Qinqin, WANG Xingxin, CHEN Huiying, XIA Jianxin, LI Hua

(College of Life and Environmental Sciences, Minzu University of China, Beijing 100081, China)

Abstract: Carbon microspheres (CMSs) as a carrier were synthesized by hydrothermal method. The Ag-loading carbon microspheres(Ag/CMSs) antibacterial agent and Ag/Re-loading carbon microspheres(Ag/Re/CMSs) composite antibacterial agent were prepared by immersing CMSs in a silver nitrate solution and rare earth nitrate solution. A series of investigations using scanning electron microscopy(SEM), X-ray diffraction(XRD), X-ray photoelectron spectrometry (XPS), transmission electron microscope(TEM) and Fourier transform infrared spectrometer(FTIR) were carried out to characterize the morphology and structure of samples. Qualitative analysis of antibacterial properties of antibacterial agent towards Escherichia col(E.coli), Staphylococcus aureus(S.aureus) and Bacillus subtilis(B.subtilis) were investigated by antibacterial ring method. The results show that the as-prepared carbon microspheres have smooth surface, uniform particle size and good monodisperse. Ag/CMSs and Ag/Re/CMSs antibacterial agents show good antibacterial effect for E.coli, S.aureus and B.subtilis.Among them,Ag/Ce/CMSs exhibits the strongest antibacterial effect.

Key words: carbon microspheres; Ag; rare earth element; antibacterial property

随着社会和经济的发展，人们日益重视周围环境安全与抗菌卫生，因此，抗菌材料受到人们广泛关注。金属银和稀土元素对多种致病菌具有强烈的杀灭效果，可以有效抑制并杀灭微生物^[1-3]，被广泛应用于抗菌材料中。抗菌材料的载体有沸石、陶瓷、碳材料等，碳微球(carbon microspheres，CMSs)因其具有良好的化学稳定性、热稳定性和优良的导电、导热等特性^[4-6]，在诸多领域具有广阔的应用前景，是一种性能优异的抗菌剂载体，目前已发现多种载银碳微球抗菌材料。许并社等^[6]采用强酸和二氯化锡活化碳微球，之后用还原法制备碳微球负载银复合材料，利用金属银的抗菌活性将其应用于水体净化中。ZHAO等^[7]用真空浸渍法在碳球表面负载银，并探讨其抗菌性能。在制造含银抗菌剂时，添加含稀土离子的可溶性盐类能够进一步提高抗菌剂的抗菌性能^[8-10]。本文作者以葡萄糖为碳源，采用水热法制备碳微球^[11]。以此碳微球为载体，采用浸渍还原法^{[6, 12-14]}将银和稀土元素负载到碳微球表面，制得载银碳微球抗菌剂(Ag/CMSs)和载银/稀土元素碳微球复合抗菌剂(Ag/Re/CMSs)，并通过抑菌环法^[15-16]评价抗菌材料的抗菌性能。

1  实验

1.1  碳微球(CMSs)的制备

称取一定量的葡萄糖粉末(3.60，5.76和7.20 g)溶解于40 mL二次蒸馏水中，配制成葡萄糖溶液。超声20 min使其充分溶解，得到澄清溶液。然后，将所得澄清溶液置于50 mL高压反应釜中，于180 ℃反应一定时间(4，6和8 h)，冷却至室温，得到黑色产物。离心分离后依次用乙醇和水分别对产物进行“超声—离心—分离”清洗3次。之后将产物置于80 ℃恒温干燥箱中干燥4 h，即制得CMSs样品。

1.2  银/碳微球(Ag/CMSs)的制备

将4 mg碳微球粉末加入到40 mL AgNO₃溶液中，其中AgNO₃为7.2 mg，混合溶液超声20 min后于80 ℃温度下反应150 min；待反应结束后，自然冷却至室温，取出产物，离心分离后依次用乙醇和水分别对产物进行“超声—离心—分离”清洗3次。之后将产物置于40 ℃恒温干燥箱中干燥12 h，即制得Ag/CMSs抗菌剂。

1.3  银/稀土元素/碳微球(Ag/Re/CMSs)的制备

将8 mg碳微球粉末加入到80 mL AgNO₃和稀土硝酸盐的混合溶液中，混合溶液超声20 min后于80 ℃温度下反应150 min；待反应结束后，自然冷却至室温，取出产物，离心分离后依次用乙醇和水分别对产物进行“超声—离心—分离”清洗3次。之后将产物置于40 ℃恒温干燥箱中干燥12 h，即制得Ag/Re/CMSs抗菌剂，其中，稀土元素(Re)为镧(La)、铈(Ce)、镨(Pr)、钕(Nd)和钐(Sm)。

1.4  结构表征

采用场发射扫描电镜(JSM-6330F型)、透射电子显微镜(GZ-STWIN型)和X线衍射仪(XD-3型)对产物的形貌结构进行表征；选用红外光谱仪(VERTEX 70型)表征产物表面官能团；通过X线光电子能谱仪(ESCLABMKII型)分析样品中元素的价态。

1.5  抗菌性能测试

通过抑菌环法测定所制备材料的抗菌性能。实验所用菌株为大肠杆菌[CMCC(B)44102]、白葡萄球菌[AS1.3374]和枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63501]，购于南京便诊生物科技有限公司。

制备抑菌剂样片：在无菌并干燥的滤纸(直径d=5 mm)上粘附厚度为1 mm的抗菌剂粉末，备用。

制备阴性对照样片：在无菌并干燥的滤纸(直径d=5 mm)上粘附厚度为1 mm的碳微球粉末，备用。

试验菌的接种：用移液枪将浓度为5×10⁵~5×10⁶ CFU/mL的试验菌悬浮液均匀滴加到营养琼脂培养基平板表面上，用无菌棉棒在培养基平板表面均匀涂抹3次。每涂抹1次，平板旋转60°，最后将无菌棉棒绕平板边缘涂抹1周，盖好培养皿，于室温下干燥5 min。

抑菌剂样片贴放：在培养皿中央放置1个空白试样作阴性对照，其余抑菌剂样片置于培养皿外围。贴放时，用无菌镊子取样片贴放于平板表面，各样片中心之间相距25 mm以上，与平板周缘相距15 mm以上。贴放后，用无菌镊子轻压样片，使其紧贴于平板表面。盖好平皿，置于37 ℃无菌箱内培养16~18 h观察结果，测量抑菌环直径并记录，从而评价抗菌材料的抗菌性能。据“消毒技术规范”，当抑菌环直径大于7 mm时，表明材料对该菌种有抗菌活性，且直径越大，材料对菌种的生长抑制作用越强。

2  结果与讨论

2.1  CMSs的红外光谱分析(IR)

通过红外光谱对碳微球的表面官能团进行分析，结果如图1所示。图1中，波数为3423 cm^-1处的强峰为碳微球表面羟基(—OH)的伸缩振动吸收峰，2923 cm^-1处的峰为C—H伸缩振动吸收峰，1707 cm^-1处的峰为羰基(C=O)伸缩振动吸收峰，1621 cm^-1处的峰为共扼烯烃的骨架振动吸收峰，1518 cm^-1处的峰为—COO—对称伸缩振动吸收峰， 1386 cm^-1处的峰为苯环骨架振动峰。图1所示特征峰表明利用水热法可制备表面含有大量—OH和C=O的碳微球，且碳微球含有苯环结构，表明葡萄糖在水解过程中产生了芳香化。由于CMSs表面带有大量的—OH及其他活性基团，这些活性基团可与Ag⁺和Re³⁺发生还原反应，使Ag⁺和Re³⁺被还原从而吸附到CMSs表面。

图1  碳微球的红外光谱图

Fig. 1  FTIR spectra of carbon microspheres

2.2  Ag/CMSs的X线衍射分析(XRD)

采用X线衍射研究样品的晶体结构，结果如图2所示。从图2可见：38.05°，44.30°，64.45°和77.30°处的衍射峰分别对应Ag的(111)，(200)，(220)和(311)晶面，说明单质银被还原出来并吸附到碳微球表面，且在样品表面形成的银为标准面心立方结构，其中(111)面衍射峰最强，表明银沿(111)方向率先生长^[17]。

图2  Ag/CMSs的X线衍射图谱

Fig. 2  XRD pattern of Ag/CMSs

2.3  Ag/La/CMSs的X线光电子能谱分析(XPS)

通过X线光电子能谱来表征抗菌剂样品中银元素与稀土元素的存在形式，图3所示为CMSs，Ag/CMSs和Ag/La/CMSs的XPS图谱。从图3可见：CMSs出现了C 1s峰和O 1s峰；而Ag/CMSs抗菌剂的XPS图谱中除了存在C 1s峰和O 1s峰外，还存在Ag 3d峰，进一步说明了银被吸附到CMSs表面；而Ag/La/CMSs的XPS图谱除了存在C 1s峰、O 1s峰和Ag 3d峰外，还出现了La 3d峰，表明银与镧均被吸附到CMSs表面。图4所示为Ag/CMSs和Ag/La/CMSs中银的XPS图谱。由图4可知：Ag 3d_3/2和Ag 3d_5/2的结合能分别为374.3 eV和368.3 eV，通过查阅XPS标准数据库可知，抗菌剂中银主要以Ag⁰和Ag₂O的形式存在。图5所示为Ag/La/CMSs中镧的XPS图谱，La 3d_5/2和La 3d_3/2的结合能分别为835 eV和852 eV，通过查阅XPS标准数据库可知，抗菌剂中镧主要以La₂O₃和La⁰的形式存在。

图3  样品的X线光电子图谱

Fig. 3  XPS spectra of samples

图4  Ag/CMSs和Ag/La/CMSs中Ag的X线光电子图谱

Fig. 4  XPS spectra of Ag in Ag/CMSs and Ag/La/CMSs

2.4  扫描电镜(SEM)和透射电镜分析(TEM)

图6(a)所示为CMSs的SEM图像，可见碳微球粒径基本均匀，表面相对光滑，分散性良好。图6(b)所示为Ag/La/CMSs的TEM图像，其中浅色区域为碳，深色部分为Ag和La，可见Ag和La分散于碳微球上。

图5  Ag/La/CMSs中La的X线光电子图谱

Fig. 5  XPS spectrum of La in Ag/La/CMSs

图6  CMSs的SEM图像与Ag/La/CMSs的TEM图像

Fig. 6  SEM image of CMSs and TEM image of Ag/La/CMSs

2.5  抗菌实验分析

2.5.1  Ag/CMSs的抗菌效果评价

实验选用大肠杆菌、白葡萄球菌和枯草芽孢杆菌作为测试菌种。表1所示为碳微球的合成参数及Ag/CMSs抗菌剂对测试菌种的抑菌环实验结果。实验结果表明：Ag/CMSs抗菌剂抗菌效果明显，其中对枯草芽孢杆菌的生长抑制作用最强，对白葡萄球菌的生长抑制作用最弱；随着葡萄糖浓度增大和反应时间延长，Ag/CMSs抗菌剂的抗菌效果逐渐减弱。实验结果表明：当葡萄糖浓度为0.5 mol/L，反应时间为4 h时，Ag/CMSs抗菌剂具有最佳的抗菌效果。

表1  Ag/CMSs对大肠杆菌(E. coli)、白葡萄球菌(S. aureus)和枯草芽孢杆菌(B. subtilis)的抗菌性能

Table 1  Antibacterial activity for Ag/CMSs toward E. coli,S. aureus and B. subtilis

2.5.2  Ag/Re/CMSs的抗菌效果评价

表2与图7所示为Ag/Re/CMSs抗菌剂对测试菌种的抑菌环实验结果。培养皿中央为CMSs样片，由图7可见：在CMSs周围均没有形成抑菌环，表明CMSs本身不具有抗菌性；Ag/Re/CMSs抗菌剂周围形成了抑菌环，与Ag/CMSs抗菌剂相比，Ag/Re/CMSs抗菌剂对大肠杆菌、白葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的抑制作用显著增强，其中Ag/Ce/CMSs的抗菌效果最强，对白葡萄球菌、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的抑菌环直径分别为17.0，18.0和18.5 mm，表明Ag/Ce/CMSs抗菌剂对枯草芽孢杆菌的抗菌效果比大肠杆菌与白葡萄球菌的抗菌效果好。

表2  Ag/Re/CMSs对大肠杆菌(E. coli)、白葡萄球菌(S. aureus)和枯草芽孢杆菌(B. Subtilis)的抗菌性能

Table 2  Antibacterial activity for Ag/Re/CMSs toward E. coli, S. aureus and B. Subtilis

图7  Ag/Re/CMSs对大肠杆菌、白葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的抑菌环测试结果

Fig. 7  Inhibition zone test results of E.coli, S.aureus and B.Subtilis of Ag/Re/CMSs

3  结论

1) 当葡萄糖浓度为0.5 mol/L，反应时间为4 h时，Ag/CMSs抗菌剂具有最佳的抗菌效果，这可能是由于在该条件下碳微球的粒径较小且粒径较均一，球形度较高。

2) 银以Ag⁰和Ag₂O的形式被吸附到CMSs表面，稀土元素以稀土氧化物和单质的形式被吸附到CMSs表面。

3) CMSs本身对大肠杆菌、白葡萄球菌和枯草芽孢杆菌不具有抗菌性，而银与稀土元素具有抗菌效果，稀土元素对银的抗菌效果会产生协同作用，可以提高抗菌剂的抗菌性能，因此，Ag/CMSs与Ag/Re/CMSs抗菌剂对上述菌种有良好的抗菌效果，且Ag/Re/CMSs的抗菌效果明显增强，其中，Ag/Ce/CMSs抗菌效果最佳。

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(编辑  陈灿华)

收稿日期：2018-02-05；修回日期：2018-04-06

基金项目(Foundation item)：国家自然科学基金重点资助项目(51609271)；中央民族大学高等学校111学科创新引智计划项目(B08044) (Project(51609271) supported by the National Natural Science Key Foundation of China; Project(B08044) supported by the 111 Innovation Induction Program of Minzu University of China)

通信作者：李华，博士，副教授，从事光电催化研究；E-mail: lihua@muc.edu.cn