微波辅助提取虎杖中白藜芦醇苷
陈晓青，孙 娟，刘 茜，童 星
(中南大学 化学化工学院，湖南 长沙，410083)
摘 要：用高效液相色谱法(HPLC)测定白藜芦醇苷的含量，并以白藜芦醇苷的提取率为参考指标，通过单因素 实验及正交实验方法对微波辅助提取法(MAE)提取虎杖中白藜芦醇苷的最佳工艺进行研究。HPLC法的色谱分析条件为：ODS-C18色谱柱(长度×直径为200 mm×4.6 mm)，以40%(体积分数)的甲醇水溶液为流动相，流速为 1 mL/min；检测波长为303 nm。研究结果表明，微波辅助提取白藜芦醇苷的最佳工艺条件为：10.000 g虎杖粗粉(2~3 mm)浸泡2 h，用70%(体积分数)乙醇水溶液提取2次，料液比为1?8，在功率650 W下微波辐射100 s，白藜芦醇苷的提取率达到91%。
关键词：虎杖；白藜芦醇苷；微波辅助提取；正交实验；高效液相色谱法
中图分类号：TQ654.2; O657.71 文献标识码：A 文章编号：1672-7207(2007)04-0686-06
Microwave-assisted extraction method for piceid from
Polygonum cuspidatum Sieb et Zucc
CHEN Xiao-qing, SUN Juan, LIU Qian, TONG Xing
(School of Chemistry and Chemical Engineering, Central South University, Changsha 410083, China)
Abstract: The microwave-assisted extraction conditions of piceid from Polygonum cuspidatum Sieb et Zucc were investigated by the orthogonal design using the content of piceid as index, determined by high performance liquid chromatography (HPLC). HPLC determination conditions were as follows: ODS-C18 column (200 mm×4.6 mm), with the mobile phase of 40%(volume fraction) CH3OH, the flow rate of 1mL/min and detection wave length of 303 nm. The result shows that the optimum extraction conditions are obtained as follows: the medicinal materials of 10.000 g, dip for 2 h, the extraction solvent of 70% (volume fraction) ethanol-water solution, the ratio of material to solvent of 1?8, microwave irradiate time of 100 s with the power of 650 W and extraction twice. And the extraction rate of piceid reaches 91%.
Key words: Polygonum cuspidatum Sieb et Zucc; piceid; microwave-assisted extraction; orthogonal experiment; high performance liquid chromatography
虎杖又名阴阳莲、苦杖，为蓼科植物虎杖(Polygonum cuspidatum Sieb et Zucc)的干燥根茎和根，我国大部分地区均有分布。本品性味微苦寒，有活血化淤、清热解毒、祛痰止咳等功效[1-3]。白藜芦醇苷(piceid)是从虎杖的干燥根茎中提取的第4种单体，现代药理学研究表明，白藜芦醇苷能减轻多种因素造成的组织器官损伤，具有保护肝脏，降血脂及抗脂质过氧化等作用[4-6]。
微波是一种波长为1~0.001 m、频率为0.3~300 GHz的电磁波。微波辅助提取中药有效成分具有选择性好、提取纯度高和高效快速的特点[7-8]。本文作者采用微波辅助提取虎杖中白藜芦醇苷，考察浸泡时间、溶剂浓度、料液比、辐射时间等因素对提取效果的影响[9-10]，确定微波辅助提取白藜芦醇苷的最佳工艺，并与传统溶剂提取法的最佳工艺进行比较[11-13]。
1 实 验
1.1 药品、试剂与仪器
a. 药品：虎杖饮片，购于湖南长沙三湘有限公司(产自湘西)，经鉴定符合中华人民共和国药典(2000版一部)中的有关规定[14]；白藜芦醇苷标准品，购于江西南昌中药固体制剂制造技术国家工程研究中心(纯 度＞98%)。
b. 试剂：95%乙醇，分析纯；色谱分析用甲醇为色谱纯；色谱分析用水为二次蒸馏水。
c. 仪器：微波反应器由Sanle WP650型家用微波炉改装而成；FW100型高速万能粉碎机；R-201旋转蒸发仪； 高效液相色谱仪(SHIMADZU，2010 A)；检测器(SPD-M10A VP)；色谱柱(ODS-C18，长度×直径为200 mm×4.6 mm)。
1.2 提取方法
a. 溶剂提取法：称取10.000 g虎杖粗粉(粒度为2~ 3 mm)，加入95%乙醇溶液150 mL，回流提取3次，每次2 h[15]。合并滤液进行减压蒸馏，回收乙醇，浓缩液加入适量水，用乙醚萃取6次，除去蒽醌类，离心过滤后得上层清液，并定容至50 mL。
b. 微波辅助提取法：在虎杖粗粉(2~3 mm)中加入乙醇水溶液，浸泡后放入微波炉(功率为650 W)，按照一定的辐射时间进行微波照射后，过滤，重复1次，合并2次提取液。减压浓缩，回收溶剂。往浓缩液中加入适量水，用乙醚萃取6次，除去蒽醌类，离心过滤后得上层清液，并定容至50 mL。
1.3 色谱条件
色谱柱为ODS-C18(200 mm×4.6 mm)；流动相为40%(体积分数)的甲醇水溶液；流速为1 mL /min；检测波长为303 nm；柱温为室温[16]。该色谱条件下的白藜芦醇苷标准品及提取液样品的色谱图如图1所示。
(a) 白藜芦醇苷标准品; (b) 样品
图1 白藜芦醇苷标准品和样品的高效液相色谱图
Fig. 1 HPLC chromatograms of piceid standard and piceid sample
1.4 白藜芦醇苷含量的测定
1.4.1 标准曲线的绘制
精确称取8.00 mg白藜芦醇苷标准品于25 mL容量瓶中，用40%甲醇水溶液制成0.320 g/L白藜芦醇苷标准溶液。然后分别吸取标准溶液1.0，2.0，3.0，4.0和5.0 mL，置于25 mL容量瓶中，配成不同浓度的标准溶液，用0.2 μm滤膜过滤后进样。每次进样5 μL，重复3次。以不同浓度标准溶液上柱后测定的峰面积(Y)为纵坐标，相对应的溶液含量(X)为横坐标，绘制标准曲线，如图2所示。样品在0.064~0.320 μg范围内与峰面积呈良好线性关系，线性方程为：Y=2 045 510X-1 487.8；线性相关系数r = 0.999 9。
图2 白藜芦醇苷标准曲线
Fig. 2 Standard curve of piceid
1.4.2 虎杖提取液中白藜芦醇苷含量的测定和提取率的计算
从所得的50 mL虎杖提取液中取1 mL，置于25 mL容量瓶中，用40%甲醇水溶液稀释至刻度，用0.2 μm微膜过滤后即为供试液，按上述色谱条件进样，每次进样5 μL，重复3次，根据线性回归方程计算样品中白藜芦醇苷的含量，再计算白藜芦醇苷的提取率(以虎杖中白藜芦醇苷的含量为1%计算)。
2 结果与讨论
2.1 单因素实验的结果与讨论
2.1.1 药材粒度的影响
称取不同粒度(饮片、粗粉(2~3 mm)、细粉(＜2 mm))的药材，进行微波辅助提取，比较药材粒度对白藜芦醇苷提取效果的影响。发现药材粒度越小，提取率越高，但粒度太细，容易粘在一起，在没有强力搅拌的情况下反而会影响提取效果，所以，确定提取粒度为粗粉(2~3 mm)。
2.1.2 溶剂体积分数的影响
称取6份虎杖粗粉，每份10.000 g，加入不同体积分数的乙醇水溶液作为提取剂，用微波辅助提取法提取2次并进行相关处理后用1.4节中的方法测定，结果如图3所示。可见，提取率随溶剂体积分数的增加先升高后降低，65%时提取效果最好。微波辅助提取法是将微波辐射与溶剂萃取结合起来，溶剂的极性是影响微波提取的重要因素，极性大的溶剂其介电常数通常较大，更容易吸收微波能；另外，溶剂的极性也是影响溶剂萃取的重要因素。可见，只有在适宜的极性溶剂中(65%乙醇溶液)，白藜芦醇苷才能达到最大的溶解度，因此，选择乙醇的体积分数为60%，65%和70%进行微波辅助提取的正交实验。
图3 溶剂体积分数对白藜芦醇苷提取率的影响
Fig.3 Effect of ethanol volume fraction on extraction rate of piceid
2.1.3 辐射时间的影响
称取6份虎杖粗粉，每份10.000 g，在以65%乙醇水溶液为提取剂的条件下，考察辐射时间对白藜芦醇苷提取率的影响，结果如图4所示。可见，当辐射时间为100 s内，白藜芦醇苷的提取率随提取时间的延长而增加，但随着辐射时间的增加，白藜芦醇苷的水解量加大，使得白藜芦醇苷的提取率又显著下降。因此，选择提取时间为80，100和120 s进行微波辅助提取的正交实验。
图4 提取时间对白藜芦醇苷提取率的影响
Fig.4 Effect of irradiate time on extraction rate of piceid
2.1.4 料液比的影响
称取6份虎杖粗粉，每份10.000 g，在以65%乙醇水溶液为提取剂，微波辐射100 s的条件下，考察料液比(即每克虎杖样品中所需提取溶剂体积)对白藜芦醇苷提取率的影响，结果如图5所示。可见，随着料液比的增加，白藜芦醇苷的提取率先增加后减少，当料液比为1?8时达到最大值。因此，选择料液比为1?6，1?8和1?10进行微波辅助提取的正交实验。
图5 料液比对白藜芦醇苷提取率的影响
Fig.5 Effect of ratio of material to solvent on extraction rate of piceid
2.1.5 浸泡时间的影响
称取6份虎杖粗粉，每份10.000 g，在以65%乙醇水溶液为提取剂，微波辐射100 s，料液比为1?8的条件下，考察浸泡时间对白藜芦醇苷提取率的影响，结果如图6所示。可见，随着浸泡时间的增加，到2 h左右白藜芦醇苷的提取率最大，然后又逐渐减小，6 h后，白藜芦醇苷的提取率再次增加，在10 h时仍继续上升，但不如2 h时的提取率高。为了节约时间和成本，选择浸泡时间为0，2和4 h进行微波辅助提取的正交实验。
2.2 微波提取正交实验的结果与讨论
在单因素实验的基础上，为优化微波辅助提取虎杖中白藜芦醇苷的工艺条件，称取9份虎杖粗粉，每份10.000 g，采用正交试验法，考察浸泡时间、溶剂浓度、料液比、辐射时间4个因素，以白藜芦醇苷的提取率为参考指标，按照L9(34)正交实验表安排实验。因素水平表见表1，微波提取正交实验结果见表2和表3。
表1 因素水平表
Table 1 Factors and levels
表2 正交实验及结果
Table 2 Results of orthogonal test
表3 方差分析表
Table 3 Analysis of variance of orthogonal test
由表2和表3可知，采用微波辅助提取法，以白藜芦醇苷的含量为考察指标，各因素对虎杖中白藜芦醇苷提取量的影响程度由大到小依次为：辐射时间，料液比，浸泡时间，溶剂浓度。其中，辐射时间、料液比对白藜芦醇苷提取量的影响较大，具有显著性差异，提取剂浓度的影响最小。因此，在实验范围内，最佳提取条件为A2B2C3D2, 即取虎杖粗粉10.000 g，浸泡2 h，用70%乙醇提取2次，料液比为1?8，微波辐射100 s，提取率达91%。
用以上确定的最佳条件，取同一批虎杖粗粉5份，每份10.000 g进行微波辅助提取，提取率分别为91.05%，90.58%，90.77%，89.85%和90.62%，平均提取率为90.57%，结果说明此提取条件稳定可行。
2.3 分析方法精密度
吸取实验号为6(见表2)的样品液5份，按白藜芦醇苷含量测定方法测定，根据线性回归方程计算其含量，其相对标准偏差为1.31%。
2.4 加标回收实验
吸取实验号为4(见表2)的样品液6份，往其中的5份加入一定量的白藜芦醇苷对照品，按上述方法测定白藜芦醇苷的含量，经计算，其平均回收率为99.56%。
2.5 微波提取法与溶剂提取法的比较
用HPLC测定按照溶剂提取最佳工艺所得的虎杖提取液中白藜芦醇苷的含量。将微波辅助提取白藜芦醇苷的工艺与溶剂法提取白藜芦醇苷的工艺进行比较，结果见表4。
表4 微波辅助提取法与溶剂提取法的比较
Table 4 Comparison between microwave-assisted extraction and solvent extraction
由表4可知，微波辅助提取法与溶剂提取法相比，提取时间大大缩短，提取剂用量约减少了2/3，产品提取率提高8%。可见，微波提取法可以提高生产效率，降低成本，减少能耗，在提取速率方面有着显著优势。
3 结 论
a. 通过实验得到了微波辅助提取虎杖中白藜芦醇苷的最佳条件：10.000 g虎杖粗粉(2~3 mm)浸泡2 h，用70%乙醇提取2次，料液比为1?8，微波辐射100 s，提取率达到91%。
b. 辐射时间、料液比对提取效果的影响最大，其次为浸泡时间，提取剂的浓度对提取的影响效果最小。
c. 采用HPLC法测定白藜芦醇苷的含量，方法简便，结果稳定可靠。白藜芦醇苷含量在0.064~0.320 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系，平均回收率为99.56%。
d. 微波对白藜芦醇苷的提取具有明显的协同作用，与溶剂提取法相比，每次提取时间减少了97倍，提取剂用量约减少2/3，产品提取率提高8%。
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收稿日期：2006-12-29
基金项目：国家自然科学基金资助项目(90209047)
作者简介：陈晓青(1965-)，女，湖南长沙人，教授，博士，从事天然药物分离分析研究
通讯作者：陈晓青，女，教授，博士；电话：13974833838；E-mail: xqchen@mail.csu.edu.cn
