采用酶法提取荷叶中的荷叶碱
钟世安，乔 蓉，李 维，袁周率，邓潇君
(中南大学 化学化工学院，湖南 长沙，410083)
摘 要：以晒干粉碎的荷叶为原料，采用纤维素酶预处理，稀盐酸浸提，超声波辅助提取，氯仿萃取方法提取荷叶碱。考察纤维素酶用量、酶解温度、酶解时间、酶解酸度、液料比、稀盐酸浸提时间、浸提液中盐酸浓度对荷叶碱提取率的影响，经紫外分光光度计检测所得荷叶碱浓度，确定最佳实验条件。研究结果表明，最佳提取工艺条件是：酶的用量为2.667×10-6 mol/(s?g)，酶解温度为50 ℃，酶解时间为2 h，酶解酸度pH=5.0，液料比为30?1，浸提时间为16 h，盐酸浓度为0.5%，荷叶碱的提取率达到1.105%。
关键词：纤维素酶；荷叶碱；荷叶；提取
中图分类号：R284.2 文献标识码：A 文章编号：1672-7207(2007)06-1135-05
Enzymatic extraction of nuciferine from lotus leaf
ZHONG Shi-an, QIAO Rong, LI Wei, YUAN Zhou-lü, DENG Xiao-jun
(School of Chemistry and Chemical Engineering, Central South University, Changsha 410083, China)
Abstract: Dried and smashed lotus leaf was used as raw materials. Nuciferine was extracted by pretreatment using cellulase, immersed into diluted hydrochloric acid, extracted by ultrasonic and chloroform, respectively. The influence of enzyme amount, enzymolysis temperature, enzymolysis time, pH of enzyme solution, the ratio of solvent volume to mass of raw materials, extraction time，concentration of hydrochloric on extraction efficiency was investigated. The optimal condition was achieved by determining the concentration of nuciferine through UV. The results show that the optimal condition of extraction is as follows: The cellulase amount is 2.667×10-6 mol/(s?g), enzymolysis temperature is 50 ℃, enzymolysis time is 2 h, enzymolysis acidity pH=5.0, the ratio of solvent volume to mass of raw materials is 30?1, extraction time is 16 h, and concentration of hydrochloric is 0.5%. The extraction ratio of lotus leaf reaches 1.105%.
Key words: cellulase; nuciferine; lotus leaf; extraction
荷叶系睡莲科、莲属中国莲的叶子，味苦涩，性平，常作为中草药，传统医学认为荷叶具有清暑利湿、升发清阳、清心去热、止血利水的活性。荷叶营养丰富，含有蛋白质、碳水化合物、维生素C、脂肪、尼克酸、硫胺素、胡萝卜素等物质，此外，还含有钙、磷、铁等微量元素及多种生物碱和黄酮类化合物，它们均具有明显的生物活性和生理功能[1-4]，其在食用及药用两方面均有较广泛的应用。荷叶碱具有降脂减肥、抗自由基、抑制高胆固醇血症和动脉硬化等药疗、食疗功效，而且还具有抗有丝分裂的作用，有较强的抑菌效果。研究建立荷叶生物碱的提取优化工艺，有利于荷叶生物碱结构和生理功能因子的研究以及荷叶保健食品、天然防腐剂的开发[5-8]。
采用传统方法如稀酸液提取、溶剂提取荷叶碱，产率不高。在此，本文作者用纤维素酶破坏细胞的天然屏障，使细胞内物质释放出来，达到提取有效成分的目的，而且实验条件较温和[9-12]。同时，探讨纤维素酶从荷叶中提取荷叶碱的影响因素。通过对酶解产物中荷叶碱的定性与定量分析[13-15]，优选出提高荷叶碱含量的最佳酶解反应条件，以期为荷叶药材资源的综合利用提供有效途径。
1 仪器与材料
a. 仪器为：756MC紫外可见分光光度计(上海精密科学仪器有限公司制造)；旋转蒸发仪(上海申生科技有限公司制造)；E1140电子天平(OHAUS CORPORATION, Switzerland)；GSY-II不锈钢电热恒温水沐浴锅(北京市医疗设备厂制造)；CQ-6超声波清洗器(上海沪超超声波仪器有限公司制造)；TGL-16G冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂制造)；SHB-B95A型循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司 制造)。
b. 材料为：纤维素酶(北京东华强盛生物技术有限公司生产，酶活力达1.333×10-6 mol/(s?g)以上)，其他试剂均为分析纯。荷叶采于藕田新鲜荷叶干燥再粉碎(过75 μm筛)而得，荷叶碱对照品来自中国药品生物制品检定所(批号为111566-200402)。
2 实验方法
2.1 定性分析
称取2份荷叶粉末5 g，其中：一份加纤维素酶，酶解2 h后；另一份不加纤维素酶，加入等量1%的盐酸溶液，浸泡12 h，超声提取20 min，抽滤，滤液经旋转蒸发仪浓缩后调pH值至3，再以4 500 r/min离心分离，清液用氯仿萃取2次，合并氯仿液，蒸干氯仿，再用稀酸溶解，加入几滴10%硅钨酸试剂。2份样品均生成淡黄色无定形沉淀[16]。
2.2 定量分析
2.2.1 对照品溶液的制备
准确称取4 mg荷叶碱对照品，置于10 mL容量瓶中，加无水乙醇溶解，定容至刻度。
2.2.2 最大吸收波长的测定
取0.1 mL对照品溶液于10 mL容量瓶中，加无水乙醇定容至刻度，在200~800 nm波长范围内扫描，发现在270 nm处有最大吸收峰。
2.2.3 标准曲线的绘制
分别吸取0.05，0.10，0.15，0.20，0.25 mL对照品溶液置于10 mL比色管中，加无水乙醇定容至刻度。以无水乙醇为空白对照试样，用紫外分光光度计在270 nm处测定其吸光度。以荷叶碱浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制其关系曲线，得回归方程Y=-8×10-4+ 70.4X(其中X为荷叶碱浓度，单位为g/L；Y为吸光度)，线性相关系数R为0.999 53。
2.3 提取方法
称取5 g荷叶粉，加1 g纤维素酶和40 mL pH=5的柠檬酸缓冲溶液，于50 ℃水浴锅恒温酶解2 h，再加入150 mL 0.5% HCl溶液，浸泡16 h，超声20 min，抽滤，滤液经旋转蒸发仪浓缩后调pH值至3，再以5 000 r/min离心分离，清液用氯仿萃取2次，合并氯仿液，蒸干氯仿，得到荷叶碱，再用无水乙醇溶解，转移至50 mL容量瓶中，测定浓度。提取率η计算公式如下：
3 结果与讨论
3.1 纤维素酶对荷叶碱提取率的影响
取2份等量荷叶碱粉末，1份加纤维素酶，另1份不加纤维素酶(空白对照)，按照上述提取方法，测定浓度，发现加纤维素酶与不加纤维素酶的荷叶碱提取率分别为1.105%和0.445%。
采用常规方法提取荷叶碱，提取率只有0.445%；用纤维素酶处理荷叶，提取率达到1.105%，大大提高了荷叶碱的提取率。
3.2 纤维素酶用量对荷叶碱提取率的影响
改变纤维素酶的用量，不改变其他条件，纤维素酶用量荷叶碱提取率影响的实验结果见图1。
从图1可以看出，加少量纤维素酶预处理，荷叶碱的提取率较低，只有0.536%；纤维素酶用量为 2.667×10-6 mol/(s?g)时，提取率最高，达到0.680%；随着纤维素酶用量的增多，荷叶碱提取率反而降低。这主要是因为纤维素酶用量少时，对细胞的天然屏障破坏不够，荷叶碱不能完全释放出来；纤维素酶用量过多时，提取率也降低，这可能是过多纤维素酶将细胞壁完全破坏，改变了荷叶碱的浸提环境，导致产率降低。
图1 纤维素酶用量对荷叶碱提取率的影响
Fig.1 Influence of enzyme amount on extraction ratio of lotus leaf
3.3 酶解时间对荷叶碱提取率的影响
改变酶解时间，固定其他条件，所得荷叶碱产率见图2。
图2 酶解时间对荷叶碱提取率的影响
Fig.2 Influence of enzymolysis time on extraction ratio of lotus leaf
由图2可见，酶解1~3 h对荷叶碱提取率的影响并不十分明显；随着酶解时间的升高，荷叶碱提取率开始缓慢上升，到2 h时达最高。纤维素酶破坏细胞的天然屏障，能释放细胞内物质，但是酶解时间过长时，提取率并不增加，随后反而稍稍有所降低，当然，这种降低趋势很缓慢。经综合考虑，选择2 h为最佳酶解时间。
3.4 酶解温度对荷叶碱提取率的影响
酶活力与酶解温度有很大关系。只有在一定温度范围内，酶才能发挥较高的效能，因而，提取荷叶碱时酶解温度对荷叶碱提取率有较大的影响，实验结果见图3。
可见，纤维素酶对酶解温度较敏感，酶解温度过高或过低都降低酶的活性，因而荷叶碱提取率也降低。结果表明：最佳酶解温度为50 ℃。
3.5 酶解酸度对荷叶碱提取率的影响
酶的催化能力除了与温度有关外，还与溶液的酸度有很大的关系。一种酶只能在一定的pH值范围内才能发挥催化作用。酶解酸度对荷叶碱提取率的影响见图4。
图3 酶解温度对荷叶碱提取率的影响
Fig.3 Influence of enzymolysis temperature on extraction ratio of lotus leaf
图4 酶解酸度对荷叶碱提取率的影响
Fig.4 Influence of enzymolysis acidity on extraction ratio of lotus leaf
图4表明，当pH值为4~5时，提取率逐渐增高，随着pH值升高，提取率反而降低。所得最佳酶解酸度为pH=5。
3.6 液料比对荷叶碱提取率的影响
取5份等量荷叶粉末，按照提取工艺进行实验，改变液料比。液料比对荷叶碱提取率的影响见图5。
图5表明：30?1为最佳液料比。若液料比过低，则浸提不充分，荷叶碱提取率不高；若液料比过高，则荷叶碱提取率也降低。其原因是：若液料比过高，则增加浓缩工作量；若浓缩时间越长，则荷叶碱氧化越多，荷叶碱损失较大。
图5 液料比对荷叶碱提取率的影响
Fig.5 Influence of solvent volume to mass of raw materials on extraction ratio of lotus leaf
3.7 浸提时间对荷叶碱提取率的影响
改变浸提时间，不改变其他实验条件，所得荷叶碱提取率不同，结果见图6。
图6 浸提时间对荷叶碱提取率的影响
Fig.6 Influence of extraction time on extraction ratio of lotus leaf
从图6可以看出，随着浸提时间的增加，荷叶碱提取率逐渐升高，浸提16 h时达到饱和，再增加浸提时间，荷叶碱反而分解，其提取率逐渐降低，可见，最佳浸提时间为16 h。
3.8 HCl浓度对荷叶碱提取率的影响
改变HCl浓度，固定其他实验条件，所得荷叶碱提取率如图7所示。
由图7可见，盐酸浓度对荷叶碱提取率影响较大。因为荷叶碱是亲脂性的叔胺，几乎不溶于水，但能溶解于稀酸中，生成盐类，若盐酸浓度过低，则限制了荷叶碱的溶解量，荷叶碱产率大大降低，只有0.254%。但并非盐酸浓度越高越好，因为若盐酸浓度过高，不仅后处理如调pH值、抽滤、减压浓缩麻烦，而且降低了荷叶碱提取率。实验结果表明，最佳盐酸浓度为0.5%。
图7 HCl浓度对荷叶碱提取率的影响
Fig.7 Influence of concentration of HCl on extraction ratio of lotus leaf
4 结 论
a. 最佳提取工艺条件如下：酶的用量为2.667×10-6 mol/(s?g)，酶解温度为50 ℃，酶解时间为2 h，酶解酸度pH=5.0，液料比为30?1，浸提时间为16 h，盐酸浓度为0.5%。
b. 使用纤维素酶处理荷叶粉，可改变细胞壁的通透性，荷叶粉中荷叶碱的提取率大大提高，达到1.105%。
c. 本实验方法反应条件温和，所需设备简单，流程简明，萃取时间短。
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收稿日期：2007-03-07；修回日期：2007-05-19
基金项目：湖南省自然科学基金资助项目(06JJ4117)
作者简介：钟世安(1972-)，男，湖南益阳人，博士，副教授，从事天然产物开发与研究
通信作者：钟世安，男，博士；电话：0731-8879672；E-mail: zhongshian@yahoo.com.cn
