文章编号：1004-0609(2012)08-2353-07

镁离子浓度对氧化亚铁硫杆菌生长动力学的影响

刘欣伟¹，冯雅丽¹，李浩然²，蔡震雷¹，杨志超¹

(1. 北京科技大学 土木与环境工程学院, 北京 100083；

2. 中国科学院 过程工程研究所生化工程国家重点实验室，北京 100190)

摘  要：在氧化亚铁硫杆菌(T. f)培养过程中其他营养物质足量的情况下，通过考察不同初始Mg²⁺浓度对氧化亚铁硫杆菌(T. f)生长活性的影响，得到在不同Mg²⁺浓度下细菌的生长曲线。结果表明：T. f对Mg²⁺具有一定的耐受能力；当培养基中ρ(Mg²⁺)≤10 g/L时，Mg²⁺对细菌生长活性影响很小；其ρ(Mg²⁺)为15 g/L时，Mg²⁺开始产生延迟效应，抑制细菌生长；ρ(Mg²⁺)为20 g/L时，细菌生长完全受到抑制。同时利用基于存在非竞争性抑制的Monod方程，建立了T. f在高Mg²⁺浓度下的生长动力学方程模型，确定在不同条件下细菌生长动力学参数，包括最大比生长速率μ_max、Monod常数K_m及镁离子抑制常数K_I。利用correl系数工具分析细菌比生长速率的实验值和模拟值之间的相关系数为 0.973，表明该动力学方程能较好地描述Mg²⁺浓度对氧化亚铁硫杆菌生长的影响。

关键词：氧化亚铁硫杆菌；生长动力学；非竞争性抑制；比生长速率

中图分类号：Q935       　　     文献标志码：A

Effect of magnesium ion concentration on growth kinetics of Thiobacillus ferroxidans

LIU Xin-wei¹, FENG Ya-li¹, LI Hao-ran², CAI Zhen-lei¹, YANG Zhi-chao¹

(1. School of Civil and Environmental Engineering, University of Science and Technology Beijing, Beijing 100083, China;

2. State Key Laboratory of Biochemical Engineering, Institute of Process Engineering,

Chinese Academy of Sciences, Beijing 100190, China)

Abstract: When the other nutrients were sufficient in the culture of Thiobacillus ferrooxidans, the impact of the different initial Mg²⁺ concentration on the activity of the growth of Thiobacillus ferrooxidans was studied, and the bacterial growth curves were obtained at different magnesium ion concentrations. The results of the experiment show that Thiobacillus ferrooxidans is tolerant to Mg²⁺ some extent. No bad effect on the growth and activity of Thiobacillus ferrooxidans by Mg²⁺ is brought when cultured in 9K medium containing ρ(Mg²⁺)≤10 g/L. The growth and activity of Thiobacillus ferrooxidans are obviously influenced by Mg²⁺ when ρ(Mg²⁺) is 15 g/L. When the concentration of Mg²⁺ is around 20 g/L, the growth and activity of Thiobacillus ferrooxidans are completely inhibited. Simultaneously the kinetic model for the growth of Thiobacillus ferrooxidans at high magnesium ion concentrations is deduced on the basis of the non-competitive inhibition of the Monod equation. The values of kinetic parameters (i.e. maximum growth rate μ_max, Monod constant K_m and magnesium ion inhibition constant K_I) under different initial experiment conditions are determined. The correlation coefficient between the simulated and experiment specific growth rates is 0.973, which shows that the kinetics equation can well describe the effect of magnesium ion concentration on the growth of Thiobacillus ferrooxidans.

Key words: Thiobacillus ferrooxidans; growth kinetics; non-competitive inhibition; specific growth rate

随着高品位镍矿资源的减少, 低品位镍矿资源目前进入开发回收阶段^[1]。从低品位矿中回收镍是我国保证镍资源供应的基础保证^[2-3]。我国金川公司 (JNMC)拥有约400 Mt低品位硫化镍矿，平均镍品位为0.60%，是典型的高镁型低品位硫化镍矿。由于高昂的成本和日趋严紧的环保要求，采用处理富矿的生产工艺处理这些贫矿是不可行的。本文作者针对金川高镁型低品位硫化镍矿的氧化亚铁硫杆菌(T. f)浸出工艺进行研究，由于该矿的主要脉石矿物为含镁高的蛇纹石及绿泥石，在细菌浸出过程中部分Mg²⁺进入溶液中。Mg²⁺对于细菌生长是必需的，但是当Mg²⁺超过细菌生长耐受范围时，过高的渗透压会导致细菌死   亡。Mg²⁺对T. f生长活性的影响，国内外已有文献报道^[4-6]，但从动力学^[7-10]方面考察Mg²⁺浓度对T. f生长动力学的影响尚未见文献报道。

在此，本文作者旨在通过监测高Mg²⁺浓度培养条件下的T. f菌生长过程，利用存在非竞争性抑制的Monod模型^[11]，得到高镁浓度培养条件下的T. f菌生长动力学方程，以期对利用T. f浸出高镁型低品位硫化镍矿的生产实践起到一定的指导作用。

1  实验

1.1  培养条件

实验用菌种氧化亚铁硫杆菌(T. f)，实验室保藏。在高镁离子浓度下经驯化后，用于实验。

培养基为9K培养基，Mg²⁺采用MgSO₄·7H₂O(化学纯)配置，培养温度为30~32 ℃，培养时间为120 h，接种浓度为1×10⁷ /mL，接种量为10%，显微镜记数。

培养方式如下：在250 mL锥形瓶中装入按上述条件配置的100 mL培养液，置于SZX-B型恒温水浴振荡摇床内，用DZS-707型多参数分析仪测定溶液氧化还原电位(φ)，定期补加蒸馏水弥补损耗的水分。

1.2  不同Mg²⁺浓度下氧化亚铁硫杆菌生长曲线的  测定

测定细菌的生长曲线对掌握高镁离子浓度下细菌生长规律很重要。实验将转代培养后的细菌分别接入初始ρ(Mg²⁺)=0.004 9~20 g/L、初始pH=1.8的培养基中，菌种浓度为1×10⁷ /mL，接种量为10%。定期测定培养基中的细菌数、亚铁离子浓度ρ(Fe²⁺)及三价铁离子浓度ρ(Fe³⁺)。

1.3  主要仪器及分析方法

主要仪器如下：722型光栅分光光度计；pHS-29A型酸度计；DZS-707型多参数分析仪；SZX-B型恒温水浴振荡摇床；XS-18电子显微镜。

分析方法如下：Fe²⁺和总铁分析采用邻菲啰啉分光光度法测定，Fe³⁺的量由总铁和Fe²⁺的量之差确定；细菌活体数采用血球计数法测定；溶液的氧化还原电位用DZS-707型多参数分析仪测定。

1.4  生长动力学模型

综合氧化亚铁硫杆菌的生长动力学模型，本文作者选择一种存在非竞争性抑制的Monod方程^[11]。该 方程表达形式简单，有利于工业应用，其公式如下：

                      (1)

设：，故式(1)可写为

                           (2)

式中：为不同时间溶液中Fe²⁺浓度；μ为比生长速率；μ_max为最大比生长速率；K_M为Monod饱和常数；ρ_I为培养基中Mg²⁺浓度；K_I为Mg²⁺的抑制常数。

2  实验结果与讨论

2.1  氧化亚铁硫杆菌生长过程中代谢变化

通过改变培养基中Mg²⁺浓度(0.004 9 g/L(基础培养基)，5，10，15和20 g/L)，对T. f菌生长过程的代谢变化进行研究，得到细胞浓度，亚铁浓度ρ(Fe²⁺)及三价铁浓度ρ(Fe³⁺)随时间的变化曲线如图1所示。

研究结果表明，适当增加培养基中Mg²⁺含量有利于细菌生长；当ρ(Mg²⁺)≤10 g/L时，Mg²⁺对细菌生长活性影响很小，不影响细菌的生长繁殖；但当溶液中Mg²⁺浓度升至15 g/L时，开始产生延迟效应，抑制细菌生长；当溶液中Mg²⁺浓度升至20 g/L时，细菌的生长繁殖完全停止，菌体开始死亡。MgSO₄是细菌培养基的主要成分，它对细菌细胞的结构如核糖体、细胞膜等的稳定性起重要作用。但随着Mg²⁺质量浓度的 升高，体系的渗透压增大，会影响细菌正常的生理功能。细菌调节体内Mg²⁺浓度的能力是有限的，因此，Mg²⁺浓度过高会造成细菌生长停滞甚至死亡。在已有文献所得T. f菌的生长动力学方程中，普遍认同金属离子对T. f菌生长的非竞争性抑制^[12-13]，在本实验中以此为基础建立动力学方程。

图1  不同Mg²⁺离子浓度下细胞浓度、ρ(Fe²⁺)及ρ(Fe³⁺)随时间的变化曲线

Fig. 1  Variation of bacteria concentration, ferrous concentration and ferric concentration with time at different Mg²⁺ concentrations:  (a) 0.004 9 g/L; (b) 5 g/L; (c) 10 g/L; (d) 15 g/L; (e) 20 g/L

2.2  不同Mg²⁺浓度对溶液氧化还原电位(φ)的影响

试验在Mg²⁺浓度为0.004 9~20 g/L范围内考察了溶液氧化还原电位φ的变化情况，结果如图2所示。

细菌生长过程中，溶液中主要发生的反应如下：

           (3)

根据能斯特方程和反应式中各物质的热力学数据，计算溶液中的氧化还原电位如式(4)

           (4)

式(4)表明随着T. f菌将溶液中的Fe²⁺氧化为Fe³⁺，Fe³⁺浓度增加，ρ(Fe³⁺)/ρ(Fe²⁺)比值增加，导致溶液氧化还原电位φ上升。由图2可知，当ρ(Mg²⁺)≤10 g/L时，溶液中最大氧化还原电位φ基本不变，为610 mV，表明细菌活性受Mg²⁺影响很小，菌体生长旺盛；当Mg²⁺浓度从10 g/L增加到20 g/L时，溶液中最大氧化还原电位φ由610 mV降低至392 mV，这也可由图1结果得到解释，随着Mg²⁺浓度增加，抑制了T. f菌的生长，导致对铁的氧化能力降低，溶液中ρ(Fe³⁺)/ρ(Fe²⁺)比值随Mg²⁺浓度的增加而降低，根据式(4)进行计算，φ值减小，实验结果与此相符。

图2  Mg²⁺浓度对培养液氧化还原电位的影响

Fig. 2  Impact of Mg²⁺ concentration on culture solution redox potential

2.3  T. f菌生长动力学参数的确定

为确定不同Mg²⁺浓度下细菌生长的最大比生长速率μ_max、Monod饱和常数K_M、Mg²⁺抑制常数K_I的值，参考GABRIEL^[14]和LIU^[15]求解动力学方程的方法进行了相关参数的求解。

细菌比生长速率μ利用两点法^[16]求解，其满足如下方程：

， (5)

式中：X为溶液中细胞的数目；t为时间。

实验采用等间隔取点分析，综合式(5)可简化为

                    (6)

动力学模型(2)可变形为

                      (7)

不同Mg²⁺浓度下T. f菌比生长速率和动力学参数的求解曲线如图3所示。

通过1/μ-1/ρ(Fe²⁺)作图，曲线y截距为1/μ′_max，x截距为-1/K_M，从而求得μ′_max、K_M。从曲线求解所得动力学模型(2)中细菌生长的动力学参数值见表1。

在T. f菌最常用的9K培养基中，MgSO₄是不可缺少的主要成分之一，一般含Mg²⁺ 0.005 g/L左右，因此可认为μ_max=μ′_max =0.192 h^-1。

由于，因此计算可得动力学模型(1)的各动力学参数如表2。

表1  细菌生长动力学参数值

Table 1  Kinetic parameters for growth of bacterium

表2  氧化亚铁硫杆菌生长动力学参数

Table 2  Kinetic parameters for growth of Thiobacillus ferrooxidans

图3中各曲线的相关性较好，R²都大于0.97，证明所得动力学参数较好地符合了实验结果。由表2可知，K_M值基本不变，这与抑制剂对酶催化反应速率的非竞争性抑制中K_M值保持恒定的结论相符^[11]。而K_I和μ_max均有不同程度的变化，这一结果与实验选择的高Mg²⁺浓度条件有关。K_I值的大小表示细菌对Mg²⁺的吸收亲和力的大小，随着Mg²⁺浓度的增加，细菌对Mg²⁺的亲和力增大，导致Mg²⁺的非竞争性抑制作用也相应增加，K_I值减小。μ_max表示T. f菌的最大比生长速率，随着Mg²⁺浓度的增加，Mg²⁺逐渐与酶活性中心以外的基团结合，故Mg²⁺与底物Fe²⁺两者没有竞争作用，但是由于Mg²⁺的结合可导致酶活性中心的结构发生改变(见图4)，消弱了底物Fe²⁺和酶活性中心的结合，导致最大反应速率μ_max的减小。

Mg²⁺浓度越高，形成不能转化为产物的EI或IES越多，K_I值越小，μ_max降低的程度也越显著，非竞争性抑制的反应机理可用式(8)表示。由于μ_max降低，酶的反应速率也相应减小。非竞争性抑制作用的强弱取决于抑制物的绝对浓度，因而不能用增大底物浓度的办法来消除此种抑制作用。

图3  不同Mg²⁺浓度下T. f菌的比生长速率和动力学求解曲线

Fig. 3  Specific growth rate of T. f ((a), (b), (c), (d)) and dynamic processing curves ((a′), (b′), (c′), (d′)) at different Mg²⁺ concentrations: (a), (a′) 0.004 9 g/L (basic medium); (b), (b′) 5 g/L; (c), (c′) 10 g/L; (d), (d′) 15 g/L

图4  非竞争性抑制示意图

Fig.4  Schematic diagram of non-competitive inhibition

                        ⁽⁸⁾

为了描述镁离子浓度对氧化亚铁硫杆菌生长动力学的影响，在动力学模型中引入初始镁离子浓度项ρ₀和初始饱和常数K_I0，动力学方程(1)可变形为

                (9)

根据上述实验数据，通过对μ_max与K_I的试差，得到氧化亚铁硫杆菌在Mg²⁺浓度为0~15 g/L范围内的生长动力学方程，如式(10)所示：

 (10)

利用correl系数工具分析理论值与实验室的相关系数为0.973，见图5。该值表明以上动力学方程能较好地描述镁离子浓度对氧化亚铁硫杆菌生长的影响。

图5  比生长速率实验室与模拟值的比较

Fig. 5  Comparison of laboratory and simulated values about specific growth rate

3  结论

1) 考察了在不同Mg²⁺浓度下，氧化亚铁硫杆菌的细菌浓度、ρ(Fe²⁺)、ρ(Fe³⁺)和溶液氧化还原电位φ随时间的变化，结果表明氧化亚铁硫杆菌(T. f)对Mg²⁺具有一定的耐受能力；当培养基中ρ(Mg²⁺)≤10 g/L时，Mg²⁺对细菌的生长活性影响很小；ρ(Mg²⁺)为15 g/L时，开始产生延迟效应，抑制细菌生长；ρ(Mg²⁺)为20 g/L时，细菌生长完全受到抑制，并且随着Mg²⁺浓度的增加，溶液氧化还原电位φ逐渐减小。

2) 利用基于存在非竞争性抑制的Monod方程，建立了T. f菌在高镁浓度下的生长动力学方程模型，得到了4个Mg²⁺浓度下细菌生长的动力学参数值，结果表明，随着Mg²⁺浓度的增加，非竞争性抑制作用增加，消弱了底物Fe²⁺ 与酶活性中心的结合，K_I和μ_max逐渐减小，这也说明在一定Mg²⁺浓度下，氧化亚铁硫杆菌才能正常生长。

3) 对实验数据进行数学推导，得出该菌种在Mg²⁺浓度为0~15 g/L范围内的生长动力学方程：

 。

利用该方程得到的比生长速率理论值与实验值的相关系数为 0.973，表明该方程能较好地描述Mg²⁺浓度对氧化亚铁硫杆菌生长情况的影响。

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(编辑 龙怀中)

基金项目：国家自然科学基金资助项目(20876160)

收稿日期：2011-07-20；修订日期：2011-11-20

通信作者：冯雅丽, 教授，博士；电话：010-62311181；E-mail: ylfeng126@126.com