DOI: 10.11817/j.issn.1672-7207.2017.06.003
AMWFA法结合HELP法在中药复杂体系中的应用
张斌1, 2，李晓如1
(1. 中南大学 化学化工学院，湖南 长沙，410083；
2. 长沙环境保护职业技术学院 环境监测系，湖南 长沙，410004)
摘要：采用交互移动窗口因子分析法(AMWFA) 对2个体系中的2组二维数据片段进行比较分析，得到2组二维数据片段中的共有组分；采用直观推导式演进特征投影法(HELP)，利用二维矩阵数据包含的色谱/光谱信息和局部因子分析以分辨出各组分的纯色谱曲线和光谱, 得到具有真实物理意义的唯一解。将AMWFA和HELP相结合，对中药复杂体系药对桂枝-荆芥进行解析。研究结果表明：AMWFA和HELP相结合能鉴定出药对与桂枝、荆芥的组分数分别为50，53 和 49 个，各占挥发油总体积分数的91.87%，86.25%和92.86%；药对与桂枝共有26个组分，与荆芥共有22个组分，产生两单味药中没有的6个新成分；采用AMWFA法结合HELP法能最大程度且准确地完成中药复杂未知体系的鉴定。
关键词：中药；交互移动窗口因子分析法(AMWFA)；直观推导式演进特征投影法(HELP)；气相色谱-质谱
中图分类号：O629.9 文献标志码：A 文章编号：1672-7207(2017)06-1425-07
Application of alternative moving window factor analysis (AMWFA) and heuristic evolving latent projections(HELP) in complicated system of Chinese medicine
ZHANG Bin1, 2, LI Xiaoru1
(1. School of Chemistry and Chemical Engineering, Central South University, Changsha 410083, China;
2. School of Environmental Monitoring, Changsha Environmental Protection College, Changsha 410004, China)
Abstract: Analysis of volatile components in herbal pair Ramulus Cinnamomi-Herba Schizonepetae (RC-HS), single herb RC and HS was performed with two-dimensional gas chromatography-mass spectrometry (GC/MS) data coupled with alternative moving window factor analysis (AMWFA) and heuristic evolving latent projections (HELP). The results show that by means of these methods of two-dimensional data,50,53 and 49 volatile chemical components in essential oil of HP RC-HS, RC and HS were determined qualitatively and quantitatively, accounting for 91.87%, 86.25% and 92.86% total volume fraction of essential oil of HP RC-HS, RC and HS, respectively. There are 26 common active constituents between HP RC-HS and single herb RC, and 22 common active constituents between HP RC-HS and single herb HS. The number of volatile chemical components in RC-HS is the result of synthesis effect from the two single herbs. Analysis of the complicated system of Chinese medicine can be performed with alternative moving window factor analysis and heuristic evolving latent projections.
Key words: Chinese herb; alternative moving window factor analysis(AMWFA); heuristic evolving latent projections (HELP); gas chromatography-mass spectrometry
中药的化学成分非常复杂，单味药一般都含有大量化合物，复方药的成分则更复杂。随着分离以及鉴定技术的发展，新型的色谱-光谱二维联用仪器使用日益广泛，如气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)、高效液相色谱-二极管阵列联用仪(HPLC-DAD)、毛细管电泳-二极管阵列联用仪(CE-DAD)等可以产生同时包含色谱和光谱信息的二维数据，并将色谱的分离能力与光谱的定性鉴定能力相结合，使全面定性、定量分析检测像中药这样的复杂成分成为可能。交互移动窗口因子分析法(AMWFA)作为化学计量学的一种分析方法[1-2]，对2个体系中的2组二维数据片段进行比较分析，最后得到2组二维数据片段中的共有组分定性结果。直观推导式演进特征投影法(HELP)利用二维矩阵数据包含的色谱/光谱信息，采用局部因子分析以分辨出各组分的纯色谱曲线和光谱，得到具有真实物理意义的唯一解[3-4]。药对桂枝-荆芥为中药复杂体系，是相须相使的解表药对[5]。桂枝(Ramulus Cinnamomi，RC)解表和营、通阳散寒、温化水气、补益里气、通瘀活血。荆芥(Herba Schizonepetae，HS)具有祛风解表，宣毒透疹，理血止痉的作用。二药相须合用，取其协同作用，可增强疏散风寒、促使发汗之功效，临床上常用于感冒风寒、发热恶寒、头痛、身痛诸症。本文分别提取桂枝、荆芥和药对桂枝-荆芥的挥发油，利用GC-MS进行分离检测，采用交互移动窗口因子法(alternative moving window factor analysis，AMWFA)对其共有组分进行比较分析[6-11]，结合直观推导式演进特征投影法 (heuristic evolving latent projections，HELP)对重叠峰进行分辨[12-15]，应用质谱库相似度匹配对各组分进行定性，采用总体积积分法进行定量分析，完成对中药复杂未知体系的鉴定。
1 实验
1.1 仪器与药材
仪器为日本岛津QP2010型气相色谱-质谱联用仪。药材为桂枝、荆芥，均购自湖南中医药研究院，经湖南中医药研究院中药研究所鉴定。
1.2 挥发油提取
取桂枝50 g、荆芥50 g和药对(桂枝50 g、荆芥50 g)按《中国药典》[16]中的挥发油测定法提取挥发油。
1.3 挥发油的测定条件
色谱条件：OV-1色谱柱(长度×内径为30.00 m× 0.25 mm)。升温程序如下：起始温度为40 ℃，以2 ℃/min升至120 ℃，再以10 ℃/min升至230 ℃，维持20 min。载气为He，流速为1.0 mL/min，进样口温度为250 ℃，界面温度为280 ℃。
质谱条件如下：EI源电子能量为70 eV，离子源温度为230 ℃，倍增电压为1.28 kV，质荷比m/z扫描范围为20~600， 扫描速率为3.8 scans/s。
1.4 数据分析
数据分析在Gateway T8100计算机上进行，程序用MATLAB 6.5编写, NIST107质谱库进行检索。
2 结果与讨论
2.1 AMWFA法对药对和单味药挥发油共有组分的比较分析
交互移动窗口因子分析法(AMWFA法)作为化学计量学的一种分析二维数据的方法，其实是多组分光谱相关色谱法(MSCC)的拓展[1-2]，目标是对2个体系中的2组二维数据片段进行比较分析，最后得到被研究的2组二维数据片段中的共有组分定性结果。该法的主要思路如下。
先在1个体系中确定1个目标矩阵X，再利用单点投影法在另一个体系中找到相关的基本矩阵Y，接着利用矩阵X的信息对矩阵Y进行正交投影，从中提取两者中的共有光谱信息。正交投影矩阵P建立如下：
P=(I-XX+)
其中：I为单位矩阵，X+为X的广义逆。用P对基本矩阵Y沿色谱方向的每一条光谱矢量yj进行投影运算：
yjop=Pyj；j=1，2，…，m
yj和yjop分别表示原始光谱和投影光谱。m是y中的色谱最大保留时间扫描点。投影矢量yjop本质上是X的正交互余空间的残差矢量。考虑到噪声等因素的影响，计算yj和yjop的内积γj，作为判别依据。
γj=(yjop)Tyj，0≤γj≤1
把所有内积γ=(γ1，γ2，…，γj，…，γm)并对保留时间或者色谱扫描点作图，即得到光谱相关色谱(MSCC)图。当γj等于0时，yjop与yj完全正交，yjop完全只剩下随机噪声，原始光谱yj与目标矩阵光谱xi高度相关，Y与X中的化学组分完全一致。反过来将Y作为目标矩阵，X作为基本矩阵进行对比分析，得到反投影多组分光谱相关色谱图(IP-MSCC)。
图1所示为桂枝、荆芥和药对桂枝-荆芥挥发油经GC-MS分离检测得到的总离子流图。以桂枝(保留时间为10.3~10.8 min)的A峰簇和桂枝-荆芥(保留时间为10.5~11.1 min)的B峰簇(图2)为例，对该法进行阐述。
图3所示为由AMWFA法获得的多组分光谱相关色谱图(MSCC)和反投影多组分光谱相关色谱图(IP-MSCC)。由图3可知：扫描点20~140区域内曲线与横坐标几乎平行，中间的凸起是由噪声引起，说明A和B峰簇互相包含于对方中，所含成分一致。为进一步确定2个体系中的共有组分数，采用AMWFA法进行共有秩分析。图4所示为共有秩分析结果，前2个拟合值几乎为0，从第3个开始明显增大，说明A和B 峰簇有2个共有组分。
按照AMWFA 法，在共有组分数为1 的区域，可以从其特征向量中获取对应的纯质谱。以A的色谱峰簇为X矩阵，B色谱峰簇为Y矩阵，以X矩阵的5~140区域为基矩阵，用移动窗口技术对Y矩阵中的5~160区域进行扫描(移动窗口数为2)，建立共有组分秩图(图5(a))及质谱自相关曲线(图5(b))。在共有组分秩图中，有2个共有组分数为 1 的区域(图中阴影部分)，其对应的质谱自相关曲线也出现 2个平台(见图5(b))，且相似度几乎为 1。可分别从这 2个平台中任意1点提取出共有组分的纯质谱即组分 1和2的质谱。鉴定出2个共有组分为benzaldehyde (C7H6O，相似度99.72%)和[1R]-2,6,6-trimethyl-Bicyclo[3.1.1]hept-2-ene(C10H16，相似度98.81%)，其相应的解析质谱图和标准质谱图见图6和图7。
图1 桂枝、药对桂枝-荆芥和荆芥挥发油的GC/MS总离子流图
Fig. 1 TICs of volatile oil from RC，RC-HS and HS
图2 10.3~10.8 min保留时间段A峰簇及10.5~11.1 min保留时间段B峰簇的总离子流曲线
Fig. 2 TIC curves for A peak cluster within 10.3-10.8 min and B peak cluster within 10.5-11.1 min
图3 MSCC和IP-MSCC 的分析结果
Fig. 3 Results obtained by MSCC and IP-MSCC analysis
图4 共有秩分析结果图
Fig. 4 Results of common rank analysis
图5 共有组分解析结果
Fig. 5 Resolution results of common components
2.2 HELP法对重叠峰的解析
直观推导式演进特征投影法(HELP)是一种逐步的推导式方式，它利用二维矩阵数据包含的色谱/光谱信息，采用局部因子分析以分辨出各组分的纯色谱曲线和光谱，得到具有真实物理意义的唯一解。该法还具有从背景扣除到满秩分辨一整套分析程序，适合于对未知分析体系直接定性定量解析，其最大的优点是能对重叠峰甚至包峰进行分析，对质谱图进行最大程度地解析。其原理见文献[3-4]，分析步骤简要如下。
1) 将色谱二维数据矩阵X沿色谱方向分解为一系列相对简单的子体系Xi，检测各个子体系Xi存在的背景与噪声，并扣除背景及噪声。
2) 根据演进特征投影图和特征结构跟踪分析秩图，了解各组分的依次流出信息，确定组分数以及各组分的选择性区域和零浓度区域。
3) 利用满秩分辨对各组分的选择性区域和零浓度区域进行分辨，获得各组分的纯色谱和光谱。
4) 将解析所得的各组分的纯色谱和光谱乘积线性相加并与实际结果进行比较，验证解析结果的可靠性。
图6 Benzaldehyde (C7H6O) 标准质谱图和解析质谱图
Fig. 6 Standard mass spectrum of Benzaldehyde (C7H6O) and resolved mass spectrum of component 1
图7 [1R]-2,6,6-trimethyl-Bicyclo[3.1.1]hept-2-ene(C10H16) 标准质谱图和解析质谱图
Fig. 7 Standard mass spectrum of [1R]-2,6,6-trimethyl-Bicyclo[3.1.1]hept-2-ene (C10H16) and resolved mass spectrum of component 2
现在以药对桂枝-荆芥(保留时间为41.9~42.2 min)的C峰簇为例，对该法进行阐述。C峰簇的总离子流图见图8。
图8 C峰簇的总离子流图
Fig. 8 TIC of C peak cluster
观察图8，此峰似乎是个单峰，但在GC-MS上检索相似度不高。图9所示为峰簇C扣除背景噪音后的秩图，按照HELP原理，有2条特征值曲线(见曲线a和b)明显高于噪声水平，说明有2组分重叠。从图9可见：区域1为组分1的纯组分区(组分1流入)；区域1+2为组分1和组分2的混合区(组分2流入)；区域2为组分2的纯组分区(组分1已流完)。
图9 峰簇C背景扣除后的秩图
Fig. 9 EFA plot for C peak cluster after deleting heteroscedastic noise
图10所示为C峰簇解析后的色谱图。由图10可知：应用HELP分析得出C峰簇是2组分体系，化学组分分别为3-Phenyl-2-propenyl acetate(C11H22O2,相似度为92.12%)和3-[2-methoxyphenyl]-2-Propenal (C10H10O2，相似度为98.63%)，其相应的标准质谱图和解析质谱图见图11和图12。
按照同样的方法，对桂枝、荆芥和药对桂枝-荆芥中的色谱峰逐步进行分辨，可得到组分的纯质谱，再用质谱库对分辨出的组分进行质谱定性检索，得到组分定性结果。采用总体积积分法，可以得到各个组分的定量分析结果。
图10 C峰簇解析后的色谱图
Fig. 10 Resolved chromatograms of C peak cluster
图11 3-Phenyl-2-propenyl acetate(C11H22O2)标准质谱图和解析质谱图
Fig. 11 Standard mass spectrum of 3-Phenyl-2-propenyl acetate(C11H22O2)and resolved mass spectrum of component 1
图12 3-[2-methoxyphenyl]-2-propenal(C10H10O2)标准质谱图和解析质谱图
Fig. 12 Standard mass spectrum of 3-[2-methoxyphenyl]-2-propenal(C10H10O2) and resolved mass spectrum of component 2
3 结论
1) 采用AMWFA法和HELP法对药对桂枝-荆芥进行解析，从药对、桂枝和荆芥中分别鉴定出50，53 和 49 个组分，分别占挥发油总体积分数的91.87%，86.25%和92.86%。药对与桂枝共有26个组分，与荆芥共有22个组分，产生了2单味药中没有的6个新成分(体积分数为1.02%)。从化学成分数量及含量看，该药对为2单味药综合作用的结果。
2) 中药为复杂未知体系，使用一般的方法难以准确定性。借助AMWFA法和HELP法进行解析，能快速地获取两者间的共有组分，对重叠峰分辨后再进行质谱库匹配，最大程度且准确地完成了化学成分的定性定量，为中药的快速发展提供了数据支持。
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(编辑 陈灿华)
收稿日期：2016-08-10；修回日期：2016-10-08
基金项目(Foundation item)：国家自然科学基金资助项目(20175036，20235020)(Projects(20175036, 20235020) supported by the National Natural Science Foundation of China)
通信作者：李晓如，教授，从事天然药物化学研究；E-mail：xrli@csu.edu.cn
