壳聚糖-L-乳酸复合不对称膜的制备与表征
徐海星1, 2，闫玉华1，万 涛1，李世普1
(1. 武汉理工大学 生物材料与工程研究中心，湖北 武汉，430070；
2. 武汉理工大学 化工学院，湖北 武汉，430070)
摘 要：对不使用任何化学引发剂在真空下使壳聚糖与L-乳酸接枝共聚进行研究，结合真空冷冻干燥工艺制备一种用于周围神经再生的复合不对称膜材料。用全反射傅里叶红外光谱、扫描电镜、差示扫描量热分析仪等进行表征。研究复合不对称膜在磷酸缓冲溶液(pH=7.4)中的溶胀性能并对其力学性能进行测定。研究结果表明：复合不对称膜具有较好的接枝效果；具有内层致密，外层疏松、排列整齐的多孔结构，孔径约100 μm；复合不对称膜的玻璃转变温度为192.982 ℃；溶涨率为接枝前的1/2到1/6；复合不对称膜的力学性能随L-乳酸与壳聚糖的质量比变化而变化，拉伸强度、弹性模量及断裂伸长率等先升后降，当L-乳酸与壳聚糖的质量比为2时，具有最大值。
关键词：壳聚糖；L-乳酸；复合不对称膜
中图分类号：TQ316.6+2 文献标识码：A 文章编号：1672-7207(2007)03-0433-06
Preparation and characterization of chitosan-L- lactic acid
composite asymmetric membrane
XU Hai-xing1, 2, YAN Yu-hua1, WAN Tao1, LI Shi-pu1
(1. Biomedical Materials and Engineering Research Center, Wuhan University of Technology, Wuhan 430070, China;
2. Department of Pharmaceutical Engineering, School of Chemical Engineering,
Wuhan University of Technology, Wuhan 430070, China)
Abstract: Chitosan-L-lactic acid composite asymmetric membrane for the regeneration of peripheral nerve was obtained by grafting L-lactic acid onto the amino groups in chitosan without any chemical initiator combined vacuum freezer drier. The composite asymmetric membranes were characterized by ATR-FTIR, DSC and SEM. The swelling property in phosphate buffer solution (PBS, pH=7.4) and the mechanical properties were also investigated. The composite asymmetric membrane has a better graft efficiency. The membrane has a dense inner layer and a loose outer layer with porous structure and the pore size is about 100 μm. The glass transition temperature is 192.982 ℃. The swelling degree is about 1/2-1/6 of chitosan and the mechanical properties change with the mass ratio of LA to CS. First, the tensile strength, modulus of elasticity and breaking elongation become strong and then they become weak. It has the maximum values when the mass ratio of LA to CS is 2.
Key words: chitosan; L-lactic acid; composite asymmetric membrane
近年来，壳聚糖(chitosan, CS)和聚乳酸(PLA)作为2种具有良好生物相容性的生物医用材料受到了广泛的关注[1-7]。壳聚糖分子结构中含有大量羟基、氨基及部分乙酰氨基等生物活性基团，分子内及分子间存在大量氢键，其结构和一些性质与细胞外基质的主要成分氨基葡聚糖非常类似，有良好的生物相容性、可降解性、无刺激性、无免疫原性和无热源反应，但其力学加工性能较差[8-9]。聚乳酸也是一种常见可降解的生物材料，具有良好的生物相容性和可加工性能，但存在着如下缺点[10-15]：
a. 降解过程中的酸致催化效应，使修复部位呈酸性不利于组织的修复与生长；
b. 疏水，无识别和结合能力，与细胞缺乏有效的粘合；
c. 不带电荷、没有可反应基团，难以修饰和改性。
理想的周围神经再生支架材料不仅要具有良好的力学性能和理想的三维多级结构，而且要具有良好的细胞亲和性，在植入时能诱导细胞快速地黏附与生 长[16-18]。因此，聚乳酸和壳聚糖作为周围神经再生支架材料都存在着一定的局限性。
以壳聚糖与L-乳酸接支共聚制备适合周围神经再生的不对称膜支架材料未见报道。在此，本文作者用壳聚糖与L-乳酸在不加任何化学引发剂的条件下通过真空反应及真空冷冻干燥工艺来制备一种不对称膜。利用壳聚糖丰富的生物活性基团以及聚乳酸良好的力学性能，构建一种具有良好力学性能、细胞亲和性和理想三维多级结构的神经再生支架材料。
1 实 验
1.1 药品、试剂与仪器
药品、试剂：壳聚糖(脱乙酰度90%，相对分子质量为80万，青岛药物研究所 食品级)；L-乳酸 (88%，天津东丽化工试剂厂 AR)；1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl)carbodiimide(EDAC，Aldrich)；其他药品、试剂，均为分析纯。
仪器: Nexus傅里叶变换红外光谱仪；JSM- 5610LV扫描电子显微镜；STA499C TG-DSC综合热分析仪；FD-1-B-80冷冻干燥机；KY8000拉力试验机。
1.2 壳聚糖-L-乳酸复合不对称膜的制备
按LA与CS质量比为1?1，2?1，3?1，4?1，配制壳聚糖-L-乳酸水溶液，水浴使之成膜，于85 ℃经真空干燥形成接枝共聚物的底膜，另取配制好的相应比例的壳聚糖-乳酸溶液，按比例分别加入定量碾细的蔗糖，作为致孔剂，待充分溶解分别铺于相应壳聚糖－乳酸比例的底膜上，冰柜冷冻过夜，于85 ℃真空冷冻干燥后真空干燥，氯仿、甲醇分别回流提取24 h后，真空冷冻干燥得壳聚糖-L-乳酸复合不对称膜。将LA与CS 质量比为1?1，2?1，3?1和4?1所得复合不对称膜分别记为CL-1，CL-2，CL-3和CL-4。
1.3 结构及形貌表征
在Nexus傅里叶变换红外光谱仪上进行全反射红外光谱测试(AFT-FT-IR)；用TG-DSC综合热分析仪进行差热分析；用JSM-5610LV扫描电子显微镜进行表面形貌测试。
1.4 性能测试
1.4.1 溶胀率
将干燥好的复合膜剪成长方形(0.5 cm×1.5 cm)，放入配置好的磷酸缓冲溶液(pH 7.4，37 ℃)中，放置12 h后取出，称量质量，计算溶胀率w：
1.4.2 力学性能
将样品切成长约6 cm、宽1 cm的条状，置于特定装置中过夜，使材料湿度恒定，用材料测试机测定拉伸强度、弹性模量及断裂伸长率，取5次平均值。
2 结果与讨论
2.1 接枝共聚
图1所示为壳聚糖-L-乳酸接枝共聚反应机理。可见，当壳聚糖溶于L-乳酸溶液中时，壳聚糖中氨基质子化和乳酸中羧基发生反应形成乳酸铵盐，促进壳聚糖的溶解，当加热溶液时，L-乳酸和壳聚糖形成的铵盐会发生脱水反应从而形成酰胺键共价结合，形成壳聚糖与乳酸的接枝共聚物。同时，在制备过程中，L-乳酸单体发生聚合反应，形成均聚物。通过氯仿、甲醇处理，未反应的L-乳酸单体和乳酸均聚物小分子可以通过溶解扩散作用去除。所以，处理前后的质量差可以反映出L-乳酸单体与壳聚糖发生接枝的接枝率。处理前后质量的损失率可用下列公式计算：
?w=(m0-m)/m0×100%。
式中：m0为处理前共聚物的质量；m为经处理后共聚物的质量。
图1 壳聚糖-L-乳酸接枝共聚的反应机理
Fig.1 Scheme of graft copolymerization of chitosan and L-lactic acid
图2所示为L-乳酸与壳聚糖投料比例对不同厚度的膜(0.07，0.15 mm)质量损失的影响。从图2可知，当LA与CS质量比低于3.0时，质量损失率随着L-乳酸量的增加而升高，当质量比达到3.0后逐渐趋于平缓，说明在真空干燥过程中，壳聚糖和L-乳酸间酰胺键的形成和L-乳酸单体之间的酯键的形成是同时发生的；当L-乳酸的加入量增加时，未反应的L-乳酸单体和均聚物相应增加，当LA与CS质量比大于3.0时，接枝率不再增加，均聚物的分子增大，使接枝的侧链变长，对质量损失率的影响趋小。另外，膜的厚度增加，使接枝反应更难进行，接枝率也下降，质量损失增加。
图2 L-乳酸与壳聚糖投料比对质量损失率的影响
Fig.2 Influence of ratios of chitosan and L-lactic acid on mass loss
2.2 全反射傅里叶红外光谱分析(ATR-FT-IR)
图3所示为壳聚糖、乳酸及其共聚物的全反射红外谱，其中CS为纯壳聚糖的红外图谱，PLLA为聚 乳酸的红外图谱；CSLA0 为未处理共聚物的红外图谱，CSLA1为壳聚糖-L-乳酸共聚物的红外图谱，OLLA为乳酸均聚物的红外图谱。CSLA0及CSLA1与CS具有相似的峰形，都存在由于六碳环—C—C—键、—C—O—键伸缩振动在894 cm-1 形成的特征峰，在1 582 cm-1左右由于酰胺Ⅰ带振动形成一个强吸收峰，但对比纯壳聚糖，CSLA1和CSLAO在1 726 cm-1左右出现一个新的吸收峰，这是由L-乳酸接枝形成的侧链和均聚物OLLA中的羧基或酯基官能团产生的，与聚乳酸的红外图谱对比发现，其明显的向低波数发生了蓝移，这是OLLA中的酯基与壳聚糖中氨基或羟基强氢键作用造成的。CSLA1和CSLAO相比，其在1 726 cm-1处的吸收峰有所减弱，这说明经过抽提处理后L-乳酸的单体和OLLA已经被洗出。与CS图谱对比，由于酰胺基相对含量增加，CSLA1在1 582 cm-1处的吸收峰明显增强，这些都证明壳聚糖和L-乳酸或其均聚物发生了共价结合，生成酰胺基。
图3 壳聚糖、乳酸及其共聚物的全反射红外谱
Fig.3 ATR-FT-IR spectrum of chitosan, L-lactic acid and their copolymer
2.3 差示扫描量热分析(DSC)
如图4所示，纯壳聚糖样品由于脱水作用在76.648 ℃产生1个放热峰，直至300 ℃，未发生熔融。接枝共聚物的玻璃化转变温度为192.982 ℃，说明壳聚糖与L-乳酸发生接枝共聚后形成的接支共聚物的结晶度降低。
图4 壳聚糖及壳聚糖-L-乳酸差热扫描图
Fig.4 DSC of CS and CS-LA
2.4 扫描电镜(SEM)
为了让受损区能与外界进行物质和信息交换，近年来高渗透、多孔的载体材料受到了重视[18-19]。载体材料的孔结构(全通透性、半通透性、不透性)对受损部位的功能恢复有着较大的影响。一般认为半通透性为最佳。究其原因，全通透性的材料因能允许包括淋巴组织、成纤维细胞等所有成分通过，易引起炎性反应和局部纤维组织增生，不利于受损区的生长；而不通透性材料因不允许任何营养物质进入，不利于与外界物质交换，使受损区不能获得良好的微环境。半通透性材料则克服了上述不足，能允许红细胞、氧气、小分子营养物质通过，阻隔了不利成分进入，其局部微环境利于受损区的再生。图5(a)所示为壳聚糖-L-乳酸复合膜材料的横截面图，由图可知这种材料是一种不对称材料，具有非常明显的结构梯度差异，其内层是一种致密的微孔结构图(5(c))，而外层则是一种疏松的排列整齐的多孔结构(图5(b))，孔径约为50 μm，且孔与孔之间互相连通。外层加入致孔剂蔗糖后，孔结构与孔径发生了明显的变化，形成了互相交叉贯穿的层状网络结构且孔径(约100 μm)增大(图5(d))。这种不对称结构不仅可起半通透性作用，使受损区能与外界进行正常的物质和信息交换，而且还能有效地阻止淋巴组织、成纤维细胞的长入，起到很好的屏障作用，是一种较理想的周围神经再生支架材料[20]。
(a) 横断面；(b) 外膜；(c) 内膜；(d) 1%蔗糖外膜
图5 复合不对称膜的表面结构
Fig.5 Surface structures of composite asymmetric membrane
2.5 性能测试
由表1可知，聚乳酸(PLLA)的溶涨率远低于壳聚糖，但拉伸强度、弹性模量及断裂伸长率均远比壳聚糖(chistosan)的高。壳聚糖经与L-乳酸接枝共聚后，溶涨率及力学性能得到了明显的提高。溶涨率只有接支前的1/2到1/6；当L-乳酸与壳聚糖质量小于2时，共聚物的拉伸强度、弹性模量及断裂伸长率随L-乳酸加入量而增强；当质量大于2时，反而下降，但均比壳聚糖的高。
表1 不同样品的溶涨率和力学性能
Table 1 Swelling and mechanical properties of different samples (n=5)
神经再生支架材料要求具有较高的溶涨率及较好的力学性能。溶涨率太低，材料的保水能力就低，不利于神经再生，而若太高，则不利于材料的植入。本研究所得的不对称膜具有适度的溶涨性能，既能起到有效地保水作用又利于植入手术；良好的力学性能在神经修复中同样起着十分重要的作用，神经导管为损伤神经生长提供通道，需要抵抗肌肉的挤压，保持管形，较高的刚性和强度保证了这些功能的实现。接枝共聚复合膜的力学性能虽比聚乳酸的低，但仍能满足神经导管再生的需要。
3 结 论
a. 通过壳聚糖与L-乳酸在真空下接枝共聚结合真空冷冻干燥工艺制备一种复合不对称膜。
b. 壳聚糖和L-乳酸发生了共价结合，形成接支共聚物。接支共聚物为玻璃态物质，与壳聚糖相比，高结晶性明显提高。
c. 制备的复合不对称膜具有非常明显的结构梯度，其内层是一种致密的微孔结构，而外层则是一种疏松的排列整齐的多孔结构，且孔与孔之间互相连通，孔结构与孔径随致孔剂的种类和比例可调。
d. 复合不对称膜的溶涨率和力学性能与壳聚糖相比均得到明显的提高。溶涨率为接枝前的1/2到1/6；力学性能随壳聚糖与L-乳酸的质量比变化而变化，拉伸强度、弹性模量及断裂伸长率等先升后降，当质量比等于2时，具有最大值。是一种较为理想的周围神经再生支架材料。
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收稿日期：2007-01-29
基金项目：国家重点基础研究发展计划资助项目(2005CB623905)
作者简介：徐海星(1973-)，男，湖北罗田人，讲师，博士研究生，从事生物医用、药用材料研究
通讯作者：闫玉华，教授，博士生导师；电话：027-87651853(O); E-mail: yanyuhua8@126.com
