羧甲基壳聚糖银噻苯咪唑的制备及其抑菌性能

夏金兰,王 春,聂珍媛,刘新星

(中南大学 资源加工与生物工程学院,湖南 长沙,410083)

摘要: 研究了一种新型广谱复合抗菌剂羧甲基壳聚糖银噻苯咪唑的制备与性能。抗菌实验结果表明:该新型复合抗菌剂能综合其单一组分抗菌剂或二元组分(羧甲基壳聚糖银和羧甲基壳聚糖噻苯咪唑)复合抗菌剂的优点,对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、黑曲霉和毛霉等代表性微生物的最小抑菌浓度分别为20×10^-6、25×10^-6、20×10^-6、40×10^-6和450×10^-6 g/mL,具有优良的广谱抗菌效果;同时,克服了银离子的变色缺陷;银和噻苯咪唑分别与高分子羧甲基壳聚糖中的胺基和羧基发生了键合作用。
关键词: 复合抗菌剂; 羧甲基壳聚糖银噻苯咪唑; 抑菌性能
中图分类号:Q939.9 文献标识码:A 文章编号: 1672-7207(2005)01-0034-04

Preparation and Antimicrobial Activity of
Carboxymethyl Chitosan-Ag-tiabendazole

XIA Jin-lan,WANG Chun,NIE Zhen-yuan, LIU Xin-xing

(School of Resource Processing and Bioengineering, Central South University, Changsha 410083, China)

Abstract: The preparation and antimicrobial activity of a new broad-spectral complex antimicrobial agent carboxymethyl chitosan-Ag-thiabendazole (CMCTS-Ag-TBZ) were studied. The results show that CMCTS-Ag-TBZ can integrate the antimicrobial characters of its monocomponent agents(CMCTS, Ag, TBZ) and bicomponents complex agents (CMCTS-Ag, CMCTS-TBZ). The minimal inhibition concentration(MIC) to some typically examples of bacteria and fungi, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Candida albicans, Aspergillus niger, Mucor sp., are 20×10^-6, 25×10^-6, 20×10^-6, 40×10^-6 and 450×10^-6 g/mL, respectively, showing a very wonderful broad-spectrum inhibition to the chosen modeled bacteria and fungi. It is found to be able to prevent change in color of Ag⁺, the defect that occurs in the monocomponent Ag antimicrobial agent. The results of infrared spectrum analysis show that Ag and thiabendazole bind respectively to the amino group and carboxyl group of the CMCTS.
Key words: complex antimicrobial agents; carboxymethyl-Ag-thiabendazole; antimicrobial activity 

目前,高效、耐久及安全的抗菌剂及其抗菌材料的研究与开发日益受到重视^[1]。由于单一种类的无机、有机或天然生物抗菌剂一般存在一些缺陷,如无机抗菌剂中的典型代表银盐对细菌抗抑性能较好,但对真菌的抗抑性能较差,且使用一定时期后容易变色,影响材料的美观;典型的有机抗菌剂 噻苯咪唑(Thiabendazole,TBZ)的抗菌性能正好与银的相反^[2];天然生物抗菌剂的典型代表壳聚糖是天然储量十分丰富的甲壳质的脱乙酰产物,有很强的生物相容性和可生物降解性等特点,但其抗菌性能不如银或TBZ等抗菌剂^[3]。值得注意的是,壳聚糖可以溶解在许多稀酸中,其分子保留了甲壳质的结构骨架,并具备一定的活性基团, 能方便地进行有目的的化学修饰,以获得新的或改进的抗菌功能。湛学军等研究了羧甲基壳聚糖银和壳聚糖银的抗菌性能^[4,5],研究结果表明,与单一的壳聚糖相比,其抗菌性能有一定的提高,但不能满足广谱抗菌的要求。在此,作者综合上述3类抗菌剂的特性,选择壳聚糖作为基体骨架材料,通过键合Ag和TBZ合成了一种新型的广谱复合抗菌剂。

1 实 验

1.1 材料与试剂

材料为:壳聚糖(脱乙酰度为90%,相对分子质量为3.05×10⁵,浙江玉环海洋生物化学有限公司生产);噻苯咪唑(纯度为95%,徐州诺恩农化有限公司生产);硝酸银(固体)、氯乙酸、氢氧化钠、乙醇、甲醇、丙酮、二甲基甲酰胺(DMF),均为分析纯试剂。

试剂为:大肠杆菌(E.coli)、毛霉(M.sp.)与黑曲霉(A.niger)菌种(由中南大学资源加工与生物工程学院提供);金黄色葡萄球菌(S.aureus)与白色念珠菌(C.albicans)菌种(由湖南师范大学生命科学院提供);牛肉膏蛋白胨固、液培养基;马铃薯固、液培养基;豆芽汁蔗糖固、液培养基。
1.2 仪 器

仪器为:740-FTIR傅里叶变换红外光谱仪(美国Nicolet公司制造);DDS-307型电导率仪(上海虹益仪器厂制造);UV-3000型紫外吸收光谱仪(日本岛津公司制造);GHP-9050隔水式恒温培养箱(上海一恒科技有限公司制造);HZQ-C空气浴振荡器(哈尔滨东明医疗仪器厂制造);LRH-250A生化培养箱(广东省医疗器械厂制造)。
1.3 实验方法
1.3.1 羧甲基壳聚糖(CMCTS)的制备及取代度的测定

称取10 g壳聚糖(CTS)于500 mL三口瓶中,加入100 mL乙醇浸泡数小时。向反应器中加入体积分数为50%的NaOH溶液60 mL,搅拌均匀后浸泡1~2 h,得碱化壳聚糖^[6]。在搅拌状态下,将50 g氯乙酸分数次加入到碱化壳聚糖中,在65 ℃反应4 h后,用冰醋酸调节pH至中性,制得粗产品。将粗产品溶于水,用丙酮沉淀后,再用95%乙醇洗涤,反复洗涤3~4次,除去醋酸钠、氯化钠等盐类。抽滤后于80℃干燥,得产品。

采用电导滴定法测定羧甲基壳聚糖的取代度^[7]。
1.3.2 羧甲基壳聚糖银(CMCTS-Ag)的制备

在磁力搅拌下,往羧甲基壳聚糖钠盐溶液中加入AgNO₃反应1 h,反应液用丙酮结晶抽滤后,先以75%乙醇反复洗涤,直至无Ag⁺检出,再用甲醇多次洗涤,于60 ℃真空干燥^[4]。银的含量采用溶量法测定。
1.3.3 羧甲基壳聚糖银TBZ(Ag-CMCTS-TBZ)的制备

称取2 g羧甲基壳聚糖银,溶于体积为200 mL,pH=4的硝酸水溶液中,在磁力搅拌下于圆底烧瓶中溶解;将2 g TBZ在室温加入反应器中,搅拌下反应2 h;然后,用浓度为1 mol/L 的NaOH溶液调至中性。所得反应液先真空过滤,取滤上物,再用DMF试剂反复洗涤多次,直到无TBZ检出,然后,用丙酮或甲醇洗去DMF,经真空干燥即得纯净产物。

TBZ的含量采用紫外吸光光度法测定^[8]。TBZ在弱碱性下易溶于乙酸乙酯,在弱酸性下易溶于水。利用此性质可从含TBZ的复合抗菌剂中提取TBZ,然后在其最大吸收波长298 nm处测定其吸光度。
1.3.4 羧甲基壳聚糖TBZ(CMCTS-TBZ)的制备

CMCTS-TBZ的制备方法与Ag-CMCTS-TBZ的制备方法类似。
1.3.5 最小抑菌浓度的测定

将每毫升试验菌悬液的菌落数调整到1.0×10⁶。试验时,取10支试管,将抗菌剂用无菌蒸馏水稀释成9种浓度,各取2 mL分别加入前9支试管中,往第10支管中加2 mL无菌蒸馏水,再向各管加2 mL无菌双倍浓缩培养基,混匀。然后,向各管加0.1 mL菌悬液,其中将细菌于37 ℃培养24 h,将真菌于28 ℃培养48 h,再从各试管中取0.1 mL培养液于琼脂平板上,同样将其中细菌于37 ℃培养24 h,将真菌于28 ℃培养48 h,以不长菌的最低浓度为最小抑菌浓度。

2 实验结果与讨论

2.1 CMCTS的取代度

经测定,本实验所制CMCTS的羧甲基取代度为1.17,其中在O-位上的取代度为0.84,在N-位上的取代度为0.33,所剩游离-NH₂的取代度为0.57。这与复合抗菌剂Ag-CMCTS-TBZ中的Ag与糖残基的摩尔比一致(见表1)。
2.2 Ag-CMCTS-TBZ的结构表征

所制羧甲基壳聚糖基抗菌剂的组成如表1所示。由表1可知,在几种复合抗菌剂中,每100个CMCTS糖残基平均结合57个Ag离子和13个TBZ分子,表明Ag离子和TBZ分子对CMCTS的结合相对独立,不对对方的复合产生影响。

表 1   壳聚糖基抗菌剂的组成
Table 1   Components of chitosan-based
antimicrobial agents

CTS的羧甲基化在N-位和O-位都会发生^[9],但主要发生在O-位上,其中因受空间位阻的影响,以在6-OH上发生为主。CMCTS,CMCTS-Ag及Ag-CMCTS-TBZ的红外光谱如图1所示。由图1可知, CMCTS红外光谱中在1605 cm^-1处出现强吸收,但在1660 cm^-1处未出现明显吸收,这2处吸收分别对应于伯酰胺和仲酰胺的N-H弯曲振动吸收,表明壳聚糖已基本上脱乙酰化^[4,10]。CMCTS红外光谱中典型的1605 cm^-1处和3441 cm^-1处—NH₂吸收峰,在CMCTS-Ag 和Ag-CMCTS-TBZ红外光谱中分别出现在1633 cm^-1,3445 cm^-1和1651 cm^-1,3447 cm^-1处,说明—NH₂基团参与了与Ag⁺的配位。CMCTS 红外光谱中,1084 cm^-1处的峰对应于仲醇的C-O伸缩振动吸收,它在CMCTS-Ag[CM(22*3] 和Ag-CMCTS-TBZ红外光谱中分别发生了强度

1—CMCTS; 2—Ag-CMCTS-TBI; 3—CMCTS-Ag
图 1   CMCTS,CMCTS-Ag及Ag-CMCTS-TBZ的
红外光谱图
Fig. 1   Infrared ray spectrogram of CMCTS,
CMCTS-Ag and Ag-CMCTS-TBZ

大大减弱和出现少许位移的现象,说明仲醇的—OH基团参与了对银离子的配位^[11]。CMCTS红外光谱中1416 cm^-1处的峰对应于羧基的对称伸缩振动吸收,它在CMCTS-Ag 红外光谱中位移到1404 cm^-1处,且强度大大减弱,而在Ag-CMCTS-TBZ红外光谱中位移到1384 cm^-1 处,且强度大大增强,说明—COOH基团参与了对银离子和TBZ的配位,而且在与TBZ结合中形成了强的氢键。由于CMCTS中部分羧羟基被银离子所键合以及TBZ 本身的空间位阻作用,导致TBZ不能达到游离的羧基取代度(见表1)。 2922 cm^-1和2854 cm^-1处的谱峰分别对应于CH₂和CH₃碳氢基团振动吸收,它们在3个红外光谱中的位置非常接近。
2.3 复合抗菌剂Ag-CMCTS-TBZ的抑菌性能

复合抗菌剂Ag-CMCTS-TBZ及其单一组分抗菌剂和二元组分(CMCTS-Ag, CMCTS-TBZ)复合抗菌剂的最小抑菌浓度如表2所示。由表2可知,羧甲基化的CTS既保持了CTS对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制性,也使不溶于水的壳聚糖转化为溶于水的CMCTS,其水溶性改性有利于制备出水溶性较好的可降解性高分子抗菌剂。抗菌剂Ag盐和CMCTS-Ag对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌等微生物表现出很强的抗菌作用,而对黑曲霉和毛霉等真菌的抑制效果并不理想,表明Ag⁺起主要抗菌作用。相反,抗菌剂TBZ和CMCTS-TBZ对黑曲霉和毛霉等真菌表现出较强的抗菌效果,对白色念珠菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌等微生物的抑制作用却较弱,表明TBZ起主要的抗菌作用。Ag-CMCTS-TBZ对各种实验菌均表现出了很强的抑菌作用,说明它综合了以上抗菌剂的抑菌特点。由于试验菌是具代表性的微生物,因此,可推知该复合抗菌剂具有很强的广谱抑菌性。

表 2   壳聚糖基抗菌剂的最小抑菌浓度
Table 2   MIC of antimicrobial agents
based chitosan 最小抑菌浓度/(10^-6 g·mL^-1) 

经测定,复合抗菌剂Ag-CMCTS-TBZ置于空气中光照下150 d未出现变色现象。红外光谱检测结果表明,由于Ag⁺和TBZ分别键合在壳聚糖的氨基和羧基上,增加了Ag⁺和TBZ在复合抗菌剂中的化学稳定性。
2.4 复合抗菌剂Ag-CMCTS-TBZ的抑菌机制

复合抗菌剂Ag-CMCTS-TBZ能综合其单一组分抗菌剂或二元组分(CMCTS-Ag, CMCTS-TBZ)复合抗菌剂的优点,即Ag⁺或TBZ分子与CMCTS形成的复合物并未改变其单质状态时的抗菌性。Ag⁺的抗菌机理可能是:

a. Ag⁺通过直接与细菌接触,Ag⁺未饱和的配位能力与菌体表面的N或O作用,破坏菌体表面活性结构,导致菌体因生理变化或活动受阻而死亡;

b. Ag⁺间接地通过在其周围产生活性氧而发挥抗菌作用,Ag⁺可使氧活化为过氧离子、过氧化氢和氢氧自由基而起到杀菌效果^[1]。在复合抗菌剂Ag-CMCTS-TBZ中,Ag⁺并未离开基质,但仍能起到杀菌的作用。因此,络合状Ag⁺(区别于游离Ag⁺)的抑菌机制仍适合这2种抗菌机理。TBZ通过干扰病原菌的有丝分裂中纺缍体的形成而影响病原菌的细胞分裂过程达到抗菌效果。在复合抗菌剂Ag-CMCTS-TBZ中,TBZ是通过氢键键合到羧甲基壳聚糖基质上,由于氢键的形成并没有改变起抗菌作用的共轭氮杂环的电性结构特点,因此,键合态TBZ仍然能像游离态TBZ一样起到抑菌作用。

3 结 论

a. 复合抗菌剂Ag-CMCTS-TBZ以天然高分子壳聚糖为载体,综合了其3种单一组分或二元组分(CMCTS-Ag, CMCTS-TBZ)的抗菌特点,具有优异的广谱抗菌性能;

b. 由于Ag⁺和TBZ均通过键合作用结合在CMCTS骨架上,克服了单一银抗菌剂的变色缺陷,也加强了TBZ的化学稳定性。该新型复合抗菌剂可广泛应用于抗菌、防霉水性涂料的研究和开发。

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收稿日期:2004-06-15

基金项目:国家教育部优秀青年教师资助计划项目(2001-1932)

作者简介:夏金兰(1964 -),男, 湖南攸县人,教授,博士,从事生物功能材料与药物研究

论文联系人: 夏金兰,男,教授;电话:0731-8879735(O);E-mail:jlxia@mail.csu.edu.cn