百合总皂甙的提取工艺

任凤莲,邱昌桂,连 琰

(中南大学 化学化工学院,湖南 长沙,410083)

摘要: 以百合中总皂甙含量为考察指标,应用正交设计对百合总皂甙提取工艺中的温度、乙醇体积分数、固液比、回流时间和提取次数进行了研究;以薯蓣皂甙为标准,香草醛-高氯酸为显色剂,冰醋酸为溶剂,用紫外可见分光光度计在波长为540 nm处对百合总皂甙的含量进行了测定。得出百合总皂甙的最佳提取工艺条件是:温度为70 ℃,乙醇体积分数为80%,固液比为1∶6,提取时间为3 h,提取次数为3次;百合中总皂甙的含量为3.48 mg/g。
关键词: 百合; 总皂甙; 提取; 工艺; 分光光度法
中图分类号:R284.2 文献标识码:A 文章编号: 1672-7207(2005)01-0069-04

Extraction Process of Total Saponins from Lilium Brownii

REN Feng-lian, QIU Chang-gui, LIAN Yan

(School of Chemistry and Chemical Engineering, Central South University, Changsha 410083, China)

Abstract: The orthogonal design was used to optimize the extraction process of total saponins from lilium brownii, five factors in extraction were optimized, i.e., temperature, volume fraction of ethanol, the ratio of solid to liquid of extraction system, reflux time and extraction times. The dioscin was used as a standard compound, the vanillin-perchloric acid as chromogenic agent, glacial acetic acid as solvent, the content of total saponins determined with UV-756 spectrophotometer at 540 nm. The result shows that the optimum extraction condition obtained is as follows: temperature of 70 ℃, alcohol volume fraction of 80%, the ratio of solid to liquid of 1∶6, reflux time of 3 h and extraction times of 3 times. And the content of total saponin in lilium brownii is 3.48 mg/g.
Key words: lilium brownii; total saponins; extraction; process; spectrophotometry 

百合(Lilium brownii)为百合科百合属植物,其肉质鳞茎的鳞片,性味甘寒,具有养阴清肺、清心安神之功效^[1]。研究结果表明,百合中主要含有酚酸甘油酯、甙类、生物碱及多糖,它们都是有药用价值的活性成分;此外,还含有磷脂、蛋白质和无机元素等^[2]。皂甙按其甙元结构可以划分为两大类:其一为甾体皂甙,另一为三萜皂甙^[3]。百合中的甙类为甾体皂甙,人们对百合皂甙的提取研究较多^[4-10],但对百合总皂甙提取工艺的研究很少。在此,作者选用百合干片为原料,进行了四水平五因素的正交试验,对其总皂甙的提取工艺进行研究。

1 实 验

1.1 仪器与试剂

仪器为:UV-756紫外可见分光光度计(上海第三分析仪器厂制造);R系列旋转蒸发仪(上海申生科技有限公司制造);电热恒温水浴锅。

试剂为:百合干片(由湖南省龙山波特公司提供);薯蓣皂甙(属于甾体皂甙)对照品。

1.2 试剂的配制
1.2.1 薯蓣皂甙对照液

称取薯蓣皂甙对照品5.0 mg,加甲醇溶解,转入50 mL容量瓶中,用甲醇稀释至刻度,摇匀。
1.2.2 水饱和正丁醇溶液

在150 mL的分液漏斗中加入21 mL水和100 mL正丁醇,振摇3 min后,静置分层,除去下层,上层则为水饱和正丁醇溶液^[11]。
1.2.3 5%的香草醛-冰醋酸液

称取0.50 g香草醛,溶解于10 mL冰醋酸中^[12]。
1.2.4 乙醇溶液

将乙醇配制成体积分数分别为60%,70%,80%和90%的溶液。
1.3 总皂甙的含量测定
1.3.1 样品提取工艺

称取百合粗粉5.0 g,按表1所示的正交试验条件,采用不同体积分数的乙醇在水浴中加热回流提取数次,合并提取液,过滤并回收乙醇,往残渣中加水使之溶解,以乙醚萃取至醚层无色,弃去醚液,水层用水饱和正丁醇萃取至正丁醇层无色,回收正丁醇后,在水浴中浓缩至干得浸膏,称其质量。
1.3.2 标准曲线的绘制

分别移取薯蓣皂甙对照液0,0.4,0.8,1.2,1.6和2.0 mL置于具塞试管内,挥干溶剂,再分别加5%香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL和高氯酸0.8 mL,混匀、密塞,置60 ℃恒温水浴中显色15 min,取出后立即以冰水冷却5 min,各加入冰醋酸5.0 mL,摇匀,静置10 min,以试剂空白为参比,用UV-756型分光光度计于波长540 nm处测其吸光度^[13]。以薯蓣皂甙质量m为横坐标,吸光度A为纵坐标,绘制薯蓣皂甙标准曲线,如图1所示。其线性方程为:
A=0.0057+0.00216m,相关系数r=0.9995。

图 1   薯蓣皂甙标准曲线图
Fig. 1   Calibration curve of dioscin

 1.3.3 百合总皂甙含量测定

称取20.0 mg按各工艺制备的浸膏,以甲醇溶解,定容至25.0 mL,吸取百合提取液各1.0 mL,置于具塞试管内。按上述绘制标准曲线方法,测定其吸光度,用标准曲线法计算其含量,结果见表2。

表 1   因素及水平表
Table 1   Factors and levels of orthogonal design

表 2   L₁₆(4⁵)正交表及实验结果分析
Table 2   Results analysis of L₁₆(4⁵) orthogonal test

2 结果与分析

2.1 正交试验设计及结果

选用L₁₆(4⁵)正交表^[14],其因素及水平见表1。其中:A为温度,℃;B为乙醇的体积分数,%;C为固液比;D为回流时间,h;E为提取次数。其实验结果见表2,方差分析^[14,15]结果见表3。

表 3   方差分析表
Table 3   Analysis of variance of orthogonal test


2.2 分析方法精密度

吸取实验号为9的样品液5份,按百合总皂甙含量测定方法测定, 用标准曲线法计算其含量,其相对标准偏差为1.68%。
2.3 加标回收实验

吸取实验号为11的样品液6份,往其中5份加入一定量的皂甙对照品,按上述方法测定百合总皂甙含量,经计算,其平均回收率为99.73%。
2.4 直观分析

各因素的极差R值如表2所示。通过比较R的大小可以得出影响总皂甙提取因素的顺序为:提取次数,温度,回流时间,固液比,乙醇的体积分数;其最佳提取条件为A₃B₃C₁D₄E₃,即用80%乙醇,固液比为1∶6,在70 ℃回流提取3次,每次3 h。
2.5 方差分析

对正交试验结果进一步作方差分析,结果见表3。经方差分析得:F_A=16.67,F_C=5.96,F_D=8.60,F_E=17.37。其中F_A,F_C,F_D和F_E均大于临界值F_0.05(3,6),说明A,C,D和E因素具有显著性差异,表明温度、固液比、回流时间和提取次数对总皂甙含量的影响显著。而乙醇的体积分数对提取效果影响较小。
2.5.1 提取温度对提取效果的影响

温度越高,分子运动越剧烈,扩散速度越快,提取效果越好,但温度过高时,皂甙提取含量反而会下降。其原因是其中的活性成分被破坏,且杂质的溶出量增加。此外,温度过高,乙醇易挥发,造成乙醇损失。故实验确定最佳提取温度为70 ℃。
2.5.2 乙醇浓度对提取效果的影响

用乙醇提取皂甙,当乙醇浓度偏低时,一些亲水性的蛋白质、粘液质、果胶、淀粉和部分多糖及其他水溶性杂质会溶于溶剂中,给后续的操作带来困难。而当乙醇浓度太高时,可使植物细胞蛋白质很快凝固,妨碍乙醇向植物细胞内渗透,影响浸出。故根据实验确定乙醇体积分数为80%。
2.5.3 固液比对提取效果的影响

根据浸没一定量百合粉末的最小溶剂体积,确定最低固液比为1∶6。实验结果表明,随着溶剂量的增加,提取效果的增加幅度不大。因此,从保证提取效果、减小溶剂用量和降低浓缩负荷3方面综合考虑,溶剂用量不宜过大,故实验确定固液比为1∶6。
2.5.4 回流时间对提取效果的影响

回流时间对提取效果有显著影响。若回流时间不够,则固液接触不充分,提取效果不好;回流时间过长时,提取含量基本不变。根据实验结果,确定回流时间为3 h。
2.5.5 提取次数对提取效果的影响

提取次数越多,提取效果越好,但是,提取次数越多,所需要的乙醇用量增加。因此,为使工艺简单,减少乙醇消耗,须减少提取次数。经实验确定,提取次数为3次。

3 结 论

采用紫外可见分光光度法在波长540 nm处测定了百合皂甙的含量,并以此为考察指标,由正交实验得出了百合总皂甙的最佳提取条件为:用80%乙醇(其体积为百合质量的6倍),在70 ℃回流提取3次,每次3 h。测得百合中总皂甙的含量为3.48 mg/g。

参考文献:

[1]中华人民共和国卫生部药典委员会.中华人民共和国药典[M].广州:广东科技出版社,1995.
Pharmacopoeia Commission of Ministry of Health, the People’s Republic of China. Pharmacopoeia of the People’s Republic of China[M]. Guangzhou:Guangdong Science and Technology Press, 1995.
[2]杨林莎,孙艳红,方晓艳. 中药百合的研究进展[J].河南中医药学刊,2000,17(1):74-76.
YANG Lin-sha, SUN Yan-hong, FANG Xiao-yan. Lilium Brownii, an Exploitable Field in New Drug Development[J]. Journal of Henan University of Chinese Medicine, 2000,17(1):74-76.
[3]管敏强,毛华明,易礼胜,等.生物活性添加剂—皂甙[J].国外畜牧科技,2001,28(5):12-15.
GUAN Ming-qiang, MAO Hua-ming, YI Li-sheng. Bioactivity Additive—Saponin[J]. Animal Science Abroad, 2001,28(5):12-15.
[4]ERDOQAN I,SENER B. A Steroidal Alkaloid from Lilium Candidum I[J]. Biochem Syst Ecol, 2001, 29(5): 535-536.
[5]ERDOGAN I, SENER B. The Chemical Constituents of Lilium Species[J]. Fabad Farm Bilimler, 2000, 25(3): 101-111.
[6]MIMAKI Y, SATON T, KURODA M, et al. Steroidal Saponins from the Bulbs of Lilium Candidum[J]. Phytochemistry, 1999, 51(4): 567-573.
[7]MIMAKI Y, SATON T, KURODA M, et al. New Steroidal Constituents from the Bulbs of Lilium Candidum[J]. Chem Pharm Bull, 1998, 46(11): 1829-1832.
[8]HALADOVA M, EISENREICHOVA E, BUCKOVA A, et al. Jatropharn 5-β-D-glucopyranoside from Lilium Candidum L[J]. Collect Czech Chem Commum, 1996, 61(11): 1662-1664.
[9]吉宏武,丁霄霖,陶冠军.液相色谱-电喷雾电离质谱与电子轰击质谱联用筛选百合中的甾体皂甙[J]. 色谱,2001,19(5):403-406.
JI Hong-wu, DING Xiao-lin, TAO Guan-jin. Screening of Steroidal Saponins from the Bulbs of Lilium Brownii Var Colchesteri by Combination of High Performance Liquid Chromatography Electrospray Ionization Mass Spectrometry and Electron Impact Mass Spectrometry[J]. Chinese Journal of Chromatography, 2001, 19(5): 403-406.
[10]ANGRAWA P K, JAIN D C, GUPTA R K, et al. ¹³CNMR Spectroscopy of Steroidal Sapogenins and Steroidal Saponins[J]. Phytochemistry, 1985, 24: 2479-2483.
[11]梁朝晖.黄豆皂甙的提取和分离方法的初探[J].中国公共卫生,1999,15(11):1043-1044.
LIANG Zhao-hui. Study on Extraction and Isolation of Soybean Saponins[J]. China Journal of Public Health, 1999,15(11):1043-1044.
[12]项昭保,唐春红,陈岗,等. 木瓜中齐墩果酸测定方法的研究[J].天然产物研究与开发,2001,13(4):23-26.
XIANG Zhao-bao, TANG Chun-hong, CHEN Gang, et al. Studied on Corlorimetric Determination of Oleanolic Acid in Chinese Quince[J]. Natural Product Research and Development, 2001,13(4):23-26.
[13]周波,程雪青,陈惠娜. 绞股蓝中总皂甙及元素含量的分析[J].广东微量元素科学,1996,3(3):58-59.
ZHOU Bo, CHEN Xue-qing, CHEN Hui-na. Assay of Ginsenosides and Elements in Gynostemma Pentaphyllum Mak[J]. Guangdong Trace Elements Science, 1996,3(3):58-59.
[14]郑用熙.分析化学中的数理统计方法[M].北京:科学出版社,1986. 180-219.
ZHENG Yong-xi. Mathematical Statistical Method in Analytical Chemistry [M]. Beijing: Science Press, 1986. 180-219.
[15]王叔淳.食品分析数理统计与质量控制[M].北京:人民卫生出版社,1991.68-101.
WANG Shu-chun. Mathematical Statistics in Food Analysis and Quality Control[M]. Beijing: People Medical Press, 1991.68-101.

收稿日期:2003-12-28

作者简介:任凤莲(1946-),女,河南叶县人,教授,主要从事分析仪器和天然产物开发研究

论文联系人: 任凤莲,女,教授;电话:0731-8836993;E-mail:renfenglian@mail.qgzxol.com